质粒最早是20世纪50年代初期在大肠杆菌中发现的，是细菌、酵母菌、放线菌等生物中独立于染色体（或拟核）以外的闭合环状双链DNA分子，具有自主复制能力，可在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。

目前，质粒已成为基因工程中一种常用、简单的载体，具有自主复制、可扩增性、可转移性、不相容性等特点，除了在科研领域的普遍应用，质粒也被广泛用于多类生物医药产品的研发生产环节，如*蛋白药物、疫苗、基因治疗药物以及CAR-T药物等。

现在分子生物学使用的质粒载体都已不是原来细菌或细胞中天然存在的质粒，而是经过了人工的改造。从不同的实验目的出发，人们设计了各种不同的类型的质粒载体。

pBR322 DNA是研究得最多、使用最早且应用最广泛的大肠杆菌质粒载体之一，该载体长度为4361个碱基，pBR322为氨苄青霉素和四环素抗性，可以用于基因克隆，有时也被用于制备DNA分子量标准。

质粒载体pBR322符号质粒载体pBR322中的“p代表质粒；“BR”代表两位两位研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首，“322”是实验编号。质粒载体pBR322具有以下特点：

➤相对分子质量较小，载体长度为4361bp。

➤带有一个复制起始位点，保证了该质粒只在大肠杆菌的细胞中行使复制的功能。

➤具有两种抗生素抗性基因，可供转化子的选择标记。

➤具有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增以后，每个细胞中可累积1000-3000份拷贝，该特性为*体DNA的制备提供了极大的方便。

质粒构建的原理与类型

由于实验室质粒的人造特性，它们也被称为“vectors”（载体）或“constructs”。为了将基因插入到载体中，科学家可以利用许多可选择的克隆方法（酶切连接法、Gateway、Golden Gate，Gibson等等）。克隆方法的选择取决于所用的质粒骨架，一旦克隆步骤完成，包含新插入基因的载体将被转化到细菌细胞中并且将转化菌液涂在含有抗生素的板子上进行选择。

外源 DNA 经 PCR 扩增后，用限制性内切酶分别切割载体和外源 DNA 片段，DNA 连接酶将二者进行连接，然后转入宿主细菌，通过筛选鉴定获得*克隆。下图即一个构建的原理图：

质粒构建原理图

目前我们在实验室中比较常用的构建克隆方法大概有以下几种：

传统的质粒*技术（酶切连接）

传统意义上，质粒*是基于碱基互补配对的原理，一般做法为：

1）通过引物在目的片段两端引入酶切位点；

2）用相同的限制性内切酶分别对目的片段和载体进行酶切处理；

3）目的片段和载体的酶切产物在体外连接；

4）连接产物转化大肠杆菌；

5）筛选*子

在实验中，我们的每一步都需要根据该目的基因与载体的特性调整实验；考虑到后续实验，在选择载体时务必要满足与宿主细胞兼容且容易检出的条件；

Gateway技术

高通量基因克隆技术（Gateway Cloning Technology），是由Invitrogen公司在二十世纪九十年代末发明并应用于分子生物学基因克隆的一项专利技术。它利用专有的*序列使得DNA片段能够更有效地被转入质粒当中，可应用于大片段的基因克隆，并且在保持正确阅读框的前提下让不同表达载体间的DNA转移成为可能。

这一技术在插入的目的DNA片段两端整合att L1和att L2两个侧端*序列（Flanking Recombination Sequence），来构建一个类似通道的结构并称之为“入门克隆”（Gateway Entry Clone），可以避免目的片段内存在切点的问题而使得大片段DNA保持其完整性，大大提高了克隆效率，常应用于大规模的DNA片段整合进同一种表达载体，因此称之为高通量基因克隆技术。