一、细胞复苏时出现状态异常的原因及解决方式？

① 污染：

培养器皿可能受到细菌、真菌或其他微生物的污染，导致细胞状态不佳。所以我们需要确保在细胞培养过程中，耗材及操作等都必须严格按照无菌要求，避免任何可能的污染源。

② 营养不足：

培养基中的营养物质不足或不平衡，无法满足细胞的需求。这时候需要根据细胞类型的需求，调整培养基成分，确保提供适当的营养物质和生长因子，保证细胞的正常生长。

③ pH值异常：

培养基的 pH 值偏高或偏低，超过了细胞所能耐受的范围。一般动物细胞大多数需要轻微的碱性条件，其pH维持在7.4时细胞生长最好。

④ 氧气和二氧化碳浓度：

培养环境中的氧气和二氧化碳浓度不合适，会直接影响细胞的呼吸和代谢。在细胞培养过程中需要提供一定量的气体（氧气和二氧化碳）。CO2具有调节pH和缓冲的作用，一般提供5% CO2。

⑤ 细胞密度过高：

细胞在培养皿中过于密集，导致缺乏足够的营养和空间。在培养过程中需要根据细胞类型和培养皿的大小，调整细胞的种植密度，确保细胞能够获得足够的营养和生长空间。

⑥ 细胞冻存方式不当：

细胞在冻存时不恰当导致细胞在-80℃冰箱或者是在液氮当中死亡，从而导致细胞无法复苏。在冻存细胞前要进行细胞计数，合理使用程序降温盒进行梯度降温。

二、细胞培养中不贴壁了怎么办？

① 消化过度：

在消化过程中缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度，镜下观察细胞剥离的状态，及时终止消化。

② 支原体污染：

取培养24小时的培养基，检测支原体。清洁培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物。

③ 培养基pH值过碱（NaHCO3分解）：

可以使用无菌醋酸溶液调整pH值或充入无菌CO2来调整培养液的PH值。

④ 细胞老化：

建议复苏新的保种细胞，一般细胞老化的细胞会持续出现较严重的形态变化或者凋亡的情况。

⑥ 接种细胞起始浓度太低或太高 。

建议调节最佳接种细胞浓度。当细胞浓度太高则贴壁位置不够，细胞浓度太低则势单力薄，培养基的轻微晃动就可能使其脱落。

三、关于培养基的常见问题

① 为什么培养基颜色会有不同深浅：

不同品类的培养基中的酚红指示剂添加含量也是不相同的，所以客户会看到不同种类的培养基会有不同颜色；一般颜色的深浅为DMEM＞MEM＞DMEM/F12＞RPMI1640＞F12。

② 培养基在冰箱中为什么颜色会变深：

因为在空气中CO2浓度低，而培养基内CO2则会逐渐溢出，HCO3-减少，就会造成培养基偏碱，液体颜色变深。

③ 培养基中含有谷氨酰胺的保存条件：

谷氨酰胺对温度比较敏感，温度越高的话降解速度越快。并且谷氨酰胺在溶液中不稳定，一般应置于-20℃冰箱中保存。加有谷氨酰胺的液体培养基应存放在2℃–8℃温度中保存。

④ DPBS和PBS有什么区别：

这两者都属于磷酸盐缓冲液，成分上只有一点点磷酸盐的含量差异，均有等渗和调节pH的功能，大多数对于细胞的使用上可以通用。

⑤ HBSS和PBS/DPBS有什么区别：

HBSS缓冲液中盐成分较PBS和DPBS更复杂，且含有葡萄糖，可为细胞提供简单的营养，而PBS/DPBS不能提供营养。