（一）思考与探究

1.限制酶在DNA的任何部位都能将DNA切开吗？以下是四种不同限制酶切割形成的DNA片段：

你是否能用DNA连接酶将它们连接起来？

2.联系你已有的知识，想一想，为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的DNA？

提示：迄今为止，基因工程中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们各自可以识别和切断DNA上特定的碱基序列。细菌中限制酶之所以不切断自身DNA，是因为微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，对于外源入侵的DNA可以降解掉。生物在长期演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵（本题不要求学生回答的完全，教师可参考教师用书中的提示，根据学生的具体情况，给予指导。上述原则也应适用于其他章节中有关问题的回答）。

3.天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？

提示：基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒（plasmid），即独立于细菌拟核DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？其实不然，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件。

（1） 载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。

（2） 载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。

（3） 载体DNA必需带有标记基因，以便*后进行*子的筛选。

（4） 载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。

（5） 载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。

实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。

4.网上查询：DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？

提示：迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。

（二）寻根问底

1.根据你所掌握的知识，你能分析出限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？

提示：原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。

2. DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？

答：不是一回事。基因工程中所用的连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为E·coliDNA连接酶。另一种是从T4噬菌体中分离得到，称为T4DNA连接酶。这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链DNA的缺口（nick），而不能连接单链DNA。DNA连接酶和DNA聚合酶都是形成磷酸二酯键（在相邻核苷酸的3位碳原子上的羟基与5位碳原子上所连磷酸基团的羟基之间形成），那么，二者的差别主要表现在什么地方呢？

（1）DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。

（2）DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNA连接酶不需要模板。

此外，二者虽然都是由蛋白质构成的酶，但组成和性质各不相同。

（三）模拟制作讨论题

1. 你模拟插入的DNA片段能称得上一个基因吗？

提示：不能。因为一般基因有上千个碱基对。

2. 如果你操作失误，碱基不能配对。可能是什么原因造成的？

提示：可能是剪切位点或连接位点选得不对（也可能是其他原因）。

（四）旁栏思考题

想一想，具备什么条件才能充当“分子运输车”？

提示：能自我复制、有一个或多个切割位点、有标记基因位点及对受体细胞无害等。