一、线性化的目的

载体的主要作用是携带目的基因进入宿主细胞内，只有当载体处于线性化状态时才能与外源目的基因完成*，构建*质粒。

与原核表达不同，在酵母表达中，用于转化的质粒或载体上往往不含有酵母自身的复制源点，如果将环状*质粒直接转入酵母细胞则不能稳定存在，所以必须进行线性化处理之后，以同源*的方式整合到酵母染色体上，这样目的基因才会在酵母细胞中稳定存在。

二、酵母体系常用载体

酵母载体类型包括酵母克隆载体、酵母表达载体以及酵母人工染色体(YAC)。

（1）酵母克隆载体：不含酵母启动子，不能在酵母中表达外源基因，可分为两类：

a. 酵母整合型质粒(yeast integrated plasmid. Yip): 带有一个酵母URA3标志基因和大肠杆菌的复制和报告基因。由于质粒DNA与酵母基因组DNA之间发生了同源*，在转化的细胞中可以检测到质粒的整合复制，转化子稳定，但转化率极低。

b. 酵母复制型质粒(Yeast replicable plasmid, Yrp): 该类载体在酵母中可以自我复制，主要有YRp, YEp和YCp

• 酵母复制质粒(YRp): 细茵质粒DNA 酵母遗传标记 酵母复制序列(ARS)，可自主复制，但稳定性差；

• 酵母附加型质粒(YEp): 细菌质粒DNA 酵母标记基因 酵母2 μM质粒，游离于核外存在并自主复制，稳定性好。2μm质粒含有自主复制起始区(ori) 和STB区，STB序列能够使质粒在供体细胞中维持稳定；

• 酵母着丝粒质粒(YCp): 该载体除含复制起点外，还有酵母菌染色体着丝粒(CEN), 因而能在染色体外自我复制，拷贝数低但很稳定，适合作亚克隆载体和构建酵母菌基因组DNA文库。

YIp: 带有一个酵母标志基因；

YRp: 在YIp的基础上添加酵母复制序列(ARS)；

YEp: 在YIp的基础上添加酵母2μM质粒。

（2）酵母表达载体：含酵母启动子，酵母表达系统的载体一般是穿梭质粒，能在酵母菌和大肠杆菌中进行复制。

酿酒酵母表达系统中*蛋白的生产可以使用三种类型的载体完成：整合质粒（YIp），附加型质粒（YEp）和着丝粒质粒（YCp）。在非常规酵母中，质粒选择受到更多限制。虽然质粒可用于三种非常规酵母，但它们的拷贝数往往较低，并且易突变。因此，基因组整合仍是首选。

毕赤酵母表达系统中常用的包括分泌表达载体和非分泌型表达载体两种：

a.毕赤酵母分泌表达载体

pPICZα A、B 和C 载体用于表达和分泌毕赤酵母中的*蛋白，可用于任何毕赤酵母菌株，包括X-33、SMD1168H 和KM71H等。

pPICZα 载体包含以下元素：

• AOX1 启动子，对相关基因进行严格调控，保证甲醇诱导表达；

• 用于*蛋白分泌的α-因子分泌信号；

• Zeocin （博莱霉素）基因用于大肠杆菌和毕赤酵母中的筛选。

•含有c-myc 抗原决定簇和(6xHis) 标签的C 端肽用于检测和纯化*融合蛋白。

b.毕赤酵母非分泌型表达载体：

pGAPZ A, B, 和C 载体（2.9 Kb）使用GAP启动子在毕赤酵母中稳定表达*蛋白。GAP启动子的*蛋白表达水平略高于AOX1启动子。与诱导型启动子对比，组成型启动子可以利用更多的碳源在毕赤酵母中表达外源蛋白。*蛋白表达为带有C端His标签的融合蛋白。Zeocin的筛选标记可以同时使用于毕赤酵母和大肠杆菌。

（3）酵母人工染色体

酵母人工染色体（YAC），是一种能够克隆长达400Kb的DNA片段的载体，含有酵母细胞中必需的端粒、着丝点和复制起始序列，是细胞内具有遗传性质的物体，易被碱性染料染成深色，所以叫染色体。

特点：容量大（50-1000kb), 稳定性差。

作用：用于构建基因组文库。

酵母中复制的必需元件包括自主复制序列（ARS）、用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒（CEN）和两个端粒（TEL）。

端粒重复序列（TEL）：定位于染色体末端一段序列，用于保护线状的DNA 不被胞内的核酸酶降解，以形成稳定的结构。

着丝粒（CEN）：有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点，使染色体在分裂过程中能正确分配到子细胞中。在YAC 中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的作用。如 pYAC4 使用的是酵母第四条染色体的着丝粒。

自主复制序列（ARS）：一段特殊的序列，含有酵母菌中 DNA 进行双向复制所必须的信号

在YAC载体中最常用的是pYAC4。由于酵母的染色体是线状的，因此其在工作状态也是线状的。但是，为了方便制备YAC载体，YAC载体以环状的方式存在，并增加了普通大肠杆菌质粒载体的复制元件和选择标记。

三、酵母系统载体选择

酵母表达产物有胞内表达和分泌到胞外表达两种方式，这取决于表达载体的选择和构建是否带有信号肽，可根据基因表达的定位及目的选择合适的酵母蛋白表达载体。

① 胞内表达载体：主要包括 pPIC3、pPICZ、pPSC3K、pHIL-D2 等。该类载体将目的基因表达在胞内，可避免酵母的糖基化，适合于通常在胞浆表达或不含-S-S-的非糖基化蛋白，较胞外分泌表达水平高但纯化相对复杂。

② 分泌到胞外表达的载体：pPIC9、pHIL-S1、pYAM75P 等。酵母本身分泌的外源蛋白很少，将外源蛋白分泌到胞外，有利于目的蛋白的纯化和积累。常用的分泌信号序列由 89 个氨基酸组成α交配因子的引导。

③ 多拷贝插入表达载体：pPIC9K、pPIC3.5K。某些情况下，*基因的多拷贝整合能够增加蛋白的表达量。

四、线性化验证及结果解读

线性化酵母前后跑对比电泳。切开后的条带应该跑的慢（4-7），完整质粒跑在前面（1-3）。

图1 载体线性化验证胶图

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