细胞凋亡或称程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD），是细胞的生命现象之一，在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生，如肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。细胞凋亡有别于细胞坏死，它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变，包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。

Annexin－Ⅴ－FITC单染法

【实验原理】

正常活细胞的磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine，PS）位于细胞膜的内侧，而凋亡细胞的PS从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin－Ⅴ（膜联蛋白－Ⅴ）是一种相对分子质量为35000～36000的Ca2＋依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。因此，将Annexin－Ⅴ进行荧光素（如FITC、PE）或生物素（Biotin）标记，以标记了的Annexin－Ⅴ作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

【材料和仪器】

1.500μl或250μl20μg／mlAnnexin－Ⅴ－FITC（膜联蛋白－Ⅴ－FITC）。

2.40ml或20ml标记缓冲液（Binding Buffe）。

3.60ml或30mlPBS（1×）、去离子水、冰块。

4.20μl、200μl及1000μl移液器和吸头、微量离心管、盖玻片（用于荧光显微镜观察）。

5. 可调速离心机、载玻片（用于荧光显微镜观察）、流式细胞仪或荧光显微镜。

【实验方法】

1. 凋亡细胞的制备：小鼠腹腔注射地塞米松25mg／kg体重，10h后解剖取胸腺，分离胸腺细胞。用PBS洗两遍，调整细胞浓度为2×106／ml，备用。

2. 取200μl细胞悬液加入1ml冷PBS，轻轻震荡使细胞悬浮，1000r／min4℃离心10min，弃上清，共三次。

3.将细胞重悬于200μl标记缓冲液中。

4.加入10μlAnnexin－Ⅴ－FITC，轻轻混匀，避光室温反应15min或4℃反应30min。

5.加入300μl标记缓冲液，立即镜检或上机（流式细胞仪）检测。

【实验结果】用荧光显微镜观察，凋亡细胞细胞膜上可见黄绿色光环（图14-1）。用流式细胞仪分析可检测凋亡细胞的百分率。

图14-1　凋亡细胞的Annexin－Ⅴ－FITC单染法结果

​

【注意事项】

1. 整个操作过程动作要尽量轻柔，切勿用力吹打细胞，尽量在4℃下操作。2.反应完毕后要尽快检测，因为细胞凋亡是一个动态的过程，反应1h后荧光强度就开始衰变。3.Annexin－Ⅴ－FITC是光敏物质，在操作时要注意避光。

【思考题】

1. Annexin－Ⅴ－FITC单染法为什么能检测凋亡细胞？

2. 实验前为什么要给小鼠注射地塞米松？其原理是什么？