成功分离中间态和激活态
很多人都知道,DNA 是人类遗传信息的主要载体,它可以指导细胞维持正常生理功能。对于细胞的正常工作和人类稳定的繁衍传承来说,保证 DNA 和基因组稳定至关重要。
然而,由于一系列内部和外部影响因素,比如氧化产生的自由基、紫外线、电离辐射、化学污染等,DNA 的损伤是不可避免的。
人体内有一套极其复杂的 DNA 损伤修复机制来应对这些损伤,因此研究相关的机理有着重要的生物学意义。
同时,对于认识癌症的发展和相关治疗来说,研究 DNA 损伤修复机制也有着重要的医学意义。原因在于,癌症的标志之一便是基因组的不稳定和不完整的 DNA 损伤机制。传统的放疗/化疗和新的合成致死疗法,都是通过破坏癌细胞的基因组稳定,来达到*死癌细胞目的进而治疗癌症。
在人类复杂的 DNA 损伤修复系统中,DNA 依赖性蛋白激酶起着控制信号传导、以及促进 DNA 断裂修复的核心作用。
DNA 依赖性蛋白激酶的出现和命名始于 20 世纪 90 年代初。当时,人们发现往细胞裂解物中添加双链 DNA,能够促进某些蛋白的磷酸化。随后,学界进一步发现 DNA 依赖性蛋白激酶全酶,包含 DNA 依赖性蛋白激酶催化亚基和 Ku70/80 异二聚体。
从晶体时代到冷冻电镜技术革命爆发以来,包括英国皇家学会院士、剑桥大学生物系教授托马斯·布伦德尔(Thomas Blundell)课题组在内的不同团队,都对 DNA 依赖性蛋白激酶相关的蛋白和复合物有着新的认识。
然而,对于 DNA 依赖性蛋白激酶全酶活化过程的具体分子机理和结构变化,人们依旧不够明晰。
而在本次研究中,目前在Thomas Blundell 课题组做博后研究的梁世康,通过激酶抑制剂来稳定蛋白激酶复合物和冷冻电镜单颗粒,借此成功分离出激酶复合物的中间态和激活态两种构象。
通过对比中间态与激活态的结构,可以了解具体的分子激活机理,揭示与激酶催化中心相隔“百里”的 DNA 末端到底是如何传导激活信号的,以及小分子配体起到的作用。
(来源:Nature Structural & Molecular Biology)
“导师免了我的后顾之忧”
在本次研究之前,梁世康已经比较熟悉激酶激活机理研究模式、以及 DNA 依赖性蛋白激酶的相关知识。
因此对于课题计划,他打算分为两步走:1)优化实验设计和条件,了解 DNA 依赖性蛋白激酶催化亚基与配体相互作用的结构;2)进一步研究全酶复合物与配体互相作用和催化机理。
(来源:Nature Structural & Molecular Biology)
在自然状态下,结合天然配体和底物的激活态激酶,一般非常不稳定且难以捕捉。不仅如此,DNA 依赖性蛋白激酶还存在其他挑战:比如复合物结构庞大且灵活度高,并拥有大量的无结构蛋白序列。
为了得到稳定的、不同形态的 DNA 依赖性蛋白激酶,研究激酶全酶与抑制剂复合物的结构,将是一个不错的办法。
通过模拟天然配体,抑制剂可以作为配体去结合相应的位点,借此起到相似的结构调节作用。同时,还可以稳定蛋白复合物结构并阻止激酶自体磷酸化所导致的后续一系列构型变化,从而减少样品的异质性,以及提高结构的解析度。
基于这一思路,首要重点在于了解抑制剂和 DNA 依赖性蛋白激酶催化亚基的相互作用。其中的难点包括蛋白本身较灵活、存在高取向偏好、有机溶剂耐受性差等。
在尝试多种样品制备方法和实验优化方法之后,梁世康终于得到了稳定可重复的实验条件,借此解析出一系列 DNA 依赖性蛋白激酶催化亚基/配体和抑制剂的复合物结构,其中包括处于临床一、二期的特异性抑制剂。
接下来,他选择了能对蛋白构型起到最稳定效果的新型抑制剂,并对继续迭代实验条件,最终完成了这项工作 [2]。
相关论文以《人类 DNA 依赖性蛋白激酶激活机制》(Human DNA-dependent protein kinase activation mechanism)为题发在Nature Structural & Molecular Biology 上。论文作者只有两位:梁世康以及导师Thomas Blundell,这也是梁世康独立完成的一项工作。