众所周知，作为医疗重要设备之一，流式细胞仪在免疫功能监测和免疫状态评估方面具有绝对优势。在本次疫情诊断治疗、药物研发和疫苗研制中，更是至关重要。

本期，小编和大家分享流式细胞术的基础原理以及应用。

流式细胞术（flow cytometry , FCM）：

是一种定量分析技术，是指利用流式细胞仪检测细胞特异性标记荧光信号而测定细胞的多种生物物理性质的方法，同时也是一项可以把具有某相同荧光信号特性的某些细胞亚群从多细胞群体中分离和富集出来的细胞分析技术。

流式细胞仪(flow cytometer)：

是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术和抗原抗体检测技术为一体的新型高科技仪器。

是以激光为光源、检测生物学颗粒理化性质的仪器。

生物学颗粒包括大的免疫复合物、DNA、 RNA、染色体、蛋白质、脂质体、细胞器、病毒颗粒、细菌、真菌、真核细胞、杂交细胞、聚集细胞等。

理化性质包括细胞大小、细胞形状、细胞膜完整性、胞浆颗粒化程度、DNA含量、总蛋白含量、酶活性等。

1934年，Moldavan使悬浮的红细胞从一个毛细玻璃管中流过，每个通过的细胞可被一个光电装置记录下来。这就是流式细胞仪的雏形。

1965年，Kamentsky用紫外吸收和可见光散射两个参数同时测量未染色细胞，给出细胞中核酸的含量和细胞大小。奠定了多参数流式细胞测量的基础。

1967年，Van Dilla和Los Alamos采用了层流流动室和氩激光器，开发出了液流束、照明光轴、检测系统三者相互垂直的流式细胞仪。这成为目前各种流式细胞仪的基础。

1969年，Fulwyler利用静电墨水喷射液滴偏转技术，建立了流式细胞分选术。

Ehrlich和Wheeless利用飞点扫描技术和缝扫描技术使零分辨率的流式细胞仪变成了低分辨率的流式细胞仪。

20世纪70年代，随着Kohler和Milstein成功提出了单克隆抗体技术和荧光标记技术，为特异研究和分析细胞奠定了良好的基础。

1973年，美国BD公司和美国斯坦福大学合作，研制开发并生产了世界上第一台商用流式细胞仪FACS I。

20世纪80年代，流式细胞仪的数据采集、存储、显示、分析日趋完善，随着样品制备方法的增加，新的荧光染料和细胞标记物的出现，使流式细胞仪的应用范围逐渐扩大。

20世纪90年代，与之配套的标本制备仪和自动进样器的问世，以及适合临床应用的单克隆抗体的增加，使流式细胞仪逐渐从科研单位进入医院的中心实验室和检验科，成为现代化的临床检验仪器的一部分。

目前，流式细胞仪同时朝着更加专业化和更加普及化的两个不同的方向发展。

根据功能不同，可分为临床型和综合型（科研型）。

根据有无细胞分选功能，可分为流式细胞分析分选仪和流式细胞分析仪。

根据结构不同，可分为一般流式细胞仪（零分辨率流式细胞仪）和狭缝扫描流式细胞仪（高分辨率流式细胞仪）。前者的激光光斑为椭圆形，光斑直径大于被检细胞体积。后者激光光束为一条线状扁平光斑，直径在3~5um。

各种型号的流式细胞仪虽然差别较大，但是基本结构是相同的，一般分为:液流系统，光路系统，电子系统和分选系统。分析型流式细胞仪主要由前面的三个部分组成，分选型流式细胞仪比分析型细胞仪多了一个分选系统。

1、液流系统

液流系统由两套紧密联系而又相互独立的液流组成，即鞘液流和样品流。鞘液流从鞘液筒开始，通过管道进入喷嘴，经喷嘴的小孔形成稳定的可见的液流。鞘液最基本的特征就是等渗，保证处于鞘液中的细胞不会因为低渗或者高渗而死亡。

样品流是上样分析的含有样品细胞的液体流，样品流开始于样品管，经过特定的专门管道进入喷嘴，然后与鞘液一起从喷嘴口射出形成可见液流，最后经过废液孔流入废液桶。上样分析时，两种液体虽然互相接触，却没有互相混合在一起，而是形成层流，样品流在中间，鞘液流在外围，而且两者所受的压力也不一样。

操作者可以通过调节样品正压和鞘液正压之差来控制上样的速度，样品的正压和鞘液正压之差越大，可见液流中样品流的直径就越大。上样分析的速度就越大。

2、光路系统

光路系统开始于激光器，激光器是流式细胞仪的必需组成元件之一，不同的激光器发出的激光照射到细胞之后产生的光信号会经过不同的光路系统被不同的通道接收，流式细胞仪需要通过光路系统，根据不同的接收通道接收，然后通过信号的强弱间接反映细胞的物理化学特性。

光路系统是由一系列的透镜，滤光片和小孔组成，根据波长的不同分离各种光信号，其中滤光片尤其重要。根据功能的不同，可以分为长通滤片，短通滤片和带通滤片三种。长通滤片功能为:波长大于特定波长的光可以通过，波长小于该波长的光被反射。短通滤片的波长小于特定波长的光可以通过，波长大于该波长的光被反射。带通滤片的功能为:波长在某特定范围的光可以通过，波长在该范围以外的光被反射。

3、电子系统

这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。

计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，也可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。

4、分选系统

分选式流式细胞仪比分析型流式细胞仪多一个系统，流式分选系统。分选型流式细胞仪能够从样品细胞中分离出目标细胞，回收后可以再培养，即分选之后的细胞是具有活性的、无菌条件下的细胞。

1、免疫表型分析的应用

检测淋巴细胞亚群，监测细胞免疫状态(淋巴细胞是机体免疫系统功能重要的大细胞群，在免疫应答过程中，末梢血淋巴细胞发育分化成为功能不同的亚群。当亚群的数量和功能发生异常时，就能导致机体免疫紊乱并产生病理变化［10-11］。FCM可以同时检测一种或几种淋巴细胞表面抗原，将不同的淋巴细胞亚群区分开来，并计算出它们相互间的比例，通过对病人淋巴细胞各亚群数量的测定来监控病人的免疫状态，并指导治疗)。

2、DNA含量及细胞周期分析

细胞周期分析:在细胞周期的各个时期，DNA的含量随各时相呈现出周期性的变化。通过核酸染料标记DNA，并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%，S%及G2/M%。了解细胞的周期分布及细胞的增殖活性。也可利用细胞周期蛋白(CYCLIN)、Ki67、核增殖抗原(PCNA)等，对细胞周期进行精确的分期：G0、G1、S、G2、M.应用于：肿瘤的早期诊断、肿瘤的良恶性判断、观察细胞的增殖状态及周期分布和疗效监测。

3、定量分析

检测细胞特异性标记物：FCM不但可以定性分析标记物，而且可以进行定量。用标记已知数量的荧光素分子的标准微球作参照，可以计算出每个细胞抗原定簇的个数。

参考文献：

《流式细胞仪的原理与应用》，铂肴医学

《由表及里——探究流式细胞仪》，探究流式细胞仪

《流式细胞仪知识大盘点》，科学仪器销售杂谈