第一章 发酵工程第一节笔记

1.发酵是指人们利用微生物在适宜的条件下，将原料通过微生物的代谢转化为人类需要的产物的过程。

2.多种微生物参与了豆腐的发酵，如酵母，曲霉，毛霉等，其中起主要作用的是毛霉。

3.泡菜的腌制过程中，利用的微生物是乳酸菌，乳酸菌是厌氧细菌，在无氧的条件下，能将葡萄糖分解生成乳酸。C6H12O6酶→2C3H6O3（乳酸）＋能量

4.酵母菌是兼性厌氧微生物，在无氧条件下能进行酒精发酵，温度是影响酵母菌生长的重要因素，酿酒酵母的最适温度是280C。C6H12O6酶→2C2H5OH（酒精）＋2CO2 能量

5.醋酸菌是好氧细菌，当氧气，糖源都充足时，能通过复杂的化学反应将糖分解成乙酸，当缺少糖原时则直接将乙醇转化为乙醛，再将乙醛变为乙酸。醋酸菌的最适生长温度30到350C。 C6H12O6 O2酶→ 2CH3COOH(乙酸) 2H2O 2CO2 能量。 C2H5OH O2酶→ CH3COOH(乙酸) H2O 能量

6.许多新鲜水果的果皮表面附着有大量的不同种类的野生酵母菌。

7.在酒精发酵的过程中，温度要控制在18-300C进行发酵，每隔12小时将瓶盖拧松一次，此后再拧紧瓶盖，通过从发酵的瓶口取样来对发酵的情况进行监测。

第一章第二节微生物培养技术及应用

1.获得纯净培养物的关键是防止杂菌污染。

2.人们按照微生物对营养物质的不同需求，配置出其生长繁殖的培养基，不含凝固剂，成液体状态的叫液体培养基，在液体培养基中加入琼脂后称为琼脂固体培养基。

3.微生物在琼脂固体培养基表面或内部生长，可以形成肉眼可见的菌落。

4.培养基的基本成分一般含有水，碳源，氮源，和无机盐等营养物质。

5.牛肉膏提供的营养是碳元磷酸盐和维生素等；蛋白胨提供的是氮源和维生素等。

6.在培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加维生素，在培养霉菌时，一般需要将培养基调至酸性，在培养细菌时，一般需要将培养基调至中性或弱碱性，在培养厌氧微生物时，需要提供无氧环境。

7.消毒是指使用较为温和的物理，化学或生物等方法*死物体表面或内部一部分微生物。

8.灭菌是指使用强烈的理化方法*死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。

9.常用的消毒方法有，煮沸消毒，巴氏消毒，化学药剂消毒法。

10.灭菌有湿热灭菌，干热灭菌，灼烧灭菌等。

11.生物消毒法是指利用生物或其代谢物，除去环境中部分微生物的方法。

12.湿热灭菌是一种利用沸水流通蒸汽或高压蒸汽进行灭菌的方法，其中高压蒸汽灭菌的效果最好，实验室常用高压蒸汽灭菌锅，在压力为100KPa，温度为1210C的条件下来灭菌。

13.培养基一般用湿热灭菌。玻璃器皿，金属用具可用干热灭菌，干热灭菌的温度在160--1700C。微生物接种工具，如涂布器，接种环，接种针和接种金属用具，可用灼烧灭菌。

14.在微生物学中，将接种于培养基内在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体，称为培养物。

15.由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。

16.检验培养基灭菌是否合格，可以将一个未接种的培养基放到适宜条件下，培养一段时间观察是否有菌落产生。

17.微生物的纯培养包括：配置培养基，灭菌，接种，分离和培养等步骤。

18.分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖，形成肉眼可见的有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。

19.酵母菌的纯培养用的培养基是马铃薯琼脂培养基。

20.平板划线法的操作过程：通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面，经过数次划线后，培养可以分离得到单菌落。

21.每次划线要从上一次划线的末端开始的目的是使菌液逐步稀释为单一菌落。

22.每次划线之前都要灼烧接种环，防止杂菌污染。

23.在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基。

24.分解尿素的酶叫脲酶。

25.对微生物计数的方法常用稀释涂布平板法和显微镜直接计数法。稀释涂布平板法记的只有活菌，死菌不被计数。显微镜计数包括活菌和死菌。

26.稀释涂布平板法的原理是，当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。

27.为了保证结果准确，一般选择菌落数为30到300的平板进行计数。同一稀释度数下，应至少对三个平板进行重复计数，然后求平均值。

28.稀释涂布平板法统计的结果比实际的往往要低，原因是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只有一个菌落，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。

29.显微镜直接计数法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量，统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和。

30.血细胞计数板常用于相对较大的酵母菌细胞，霉菌，孢子等计数，用细菌计数板可对细菌等较小的细胞进行观察和计数。

31.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的实验步骤：土壤取样，样品稀释，微生物的培养和观察。

32. 细菌计数一般选择1×104，1×105和1×106倍稀释的稀释液进行平板培养。

33.不同种类的微生物往往需要不同的培养温度和培养时间，细菌一般在30-370C的温度下培养1--2天。

34.每隔24小时统计一次菌落数目，目的是避免因时间不足而遗漏菌种的数量。

35.一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出各自稳定的菌落特征，如形态大小，颜色以及隆起程度等。

第一章第三节

1.发酵工程一般包括菌种的选育，扩大培养，培养基的配制，灭菌，接种，发酵和产品的分离，提纯等。

2.选育菌种可以从自然界筛选，也可以通过诱变育种或基因工程获得。生产柠檬酸需要筛选产酸量高的黑曲霉。

3.在发酵之前，还需要对菌种进行扩大培养。

4.发酵是发酵工程的中心环节，要随时检测培养液中微生物数量，产物浓度，及了解发酵进程，还要及时添加必需的营养组分，严格控制温度、PH、溶解氧等发酵条件。

5.如果发酵产品是微生物细胞本身，可在发酵结束后，采用过滤，沉淀等方法将菌体分离和干燥。如果产品是代谢物，可根据产物的性质采取适当的提取分离和纯化来获得产品。

6.发酵工程在食品工程方面的应用包含：生产传统的发酵产品；生产各种各样的食品添加剂；生产酶制剂。

7.发酵工程在农牧业的应用：生产微生物肥料；生产微生物农药；生产微生物饲料。

第二章第一节植物细胞工程

1.细胞工程是指应用细胞生物学分子，生物学和发育生物学等多种学科的原理和方法，通过细胞器，细胞或组织水平上的操作，有目的的获得特定的细胞，组织，器官，个体或其他产品的一门综合性的生物工程。

2.细胞经分裂和分化后，仍然具有产生完整生物体，或分化成其他各种细胞的潜能，即细胞具有全能性。

3.在生物的生长发育过程中，并不是所有的细胞都表现出全能性，这是因为在特定的时间和空间条件下，细胞中基因会选择性表达。

4.植物组织培养是指将离体的植物器官，组织或细胞等，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其形成完整植株的技术。

5.离体培养的植物器官组织或细胞称为外植体。

6.植物组织培养流程过程：接种外植体，脱分化形成愈伤组织，再分化诱导生芽，诱导生根，最后移栽成活。

7.一定的激素和营养等条件的诱导下，已经分化的细胞可以经过脱分化，即失去特定的结构和功能转变成未分化的细胞，进而形成不定型的薄壁组织团，称为愈伤组织。

8.愈伤组织能重新分化成芽根等器官，该过程称为再分化。

9.植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂脱分化和再分化的关键激素，它们的浓度，比例等都会影响植物细胞发育的方向。

10.一般情况下：生长素/细胞分裂素：比值高，有利于根分化，抑制芽的形成；比值低，有利于芽分化，抑制根形成；比例适中，有利于愈伤组织生长。

11.接种外植体的方向不要倒插。由于植物生长素在从形态学上端向形态学下端运输过程是一个极性运输的过程，而生长素可以促进植物的生根以及生长发育，所以，在植物组织离体培养中外植体如果倒插的话，则会造成外植体在培养基中不能正常的完成生根及相关发育。

12.诱导愈伤组织期间一般不需要光照，在后续培养过程中，每日需要给予适当的时间和强度的光照。脱分化阶段：避光培养，有利于脱分化产生愈伤组织（如果是在光照条件下，容易分化产生维管等组织，不利于产生大量的愈伤组织）。再分化阶段：一定要有光照，有利于叶片内叶绿素的合成。

13. 不同的植物细胞之间是不能杂交的，因为存在生殖隔离。

14.植物体细胞杂交技术的步骤，在进行体细胞杂交之前，必须先利用纤维素酶和果胶酶，除去细胞壁，获得原生质体。

15.人工诱导原生质体融合的方法分为两类，物理法和化学法。物理法包括电融合法，离心法等，化学法包括聚乙二醇PEG融合法，高Ca2 和高PH融合法。融合后得到的杂种细胞，再经过诱导可形成愈伤组织，并进一步发育为完整的杂种植株。

16.植物体细胞杂交是指将不同来源的植物体细胞在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新植物体的技术。

17.植物体细胞杂交技术在打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种等方面展示出独特的优势。

18.植物繁殖的新途径：快速繁殖：作物脱毒。

19.作物新品种的培育：单倍体育种，突变体的应用。

20.单倍体育种可以通过花药培养获得单倍体植株，然后经过诱导染色体加倍就能培育出遗传性状稳定的纯合二倍体植株，这极大地缩短育种年限，节约了人力物力。

21.细胞产物的工厂化生产：细胞代谢会产生一些一般认为不是植物基本的生命活动必须的产物——次生代谢物，次生代谢物是一类小分子的有机物，与在植物抗病抗虫方面发挥作用也是很多药物、香料和色素等的重要来源。

22.紫杉醇存在于红豆杉植物体内的一种次生代谢物，具有高抗癌活性，现已被广泛用于乳腺癌等癌症的治疗。

第二章第二节动物细胞工程

1.动物细胞工程常用的技术包括动物细胞培养，动物细胞融合和动物细胞核移植等。其中，动物细胞培养是动物细胞工程的基础。

2.动物细胞培养所需要的营养条件包括糖类，氨基酸，无机盐和维生素等，其他条件如无菌无毒的环境，适宜的温度，PH和渗透压，适宜的气体条件等。

3.将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配置而成的培养基称为合成培养基。对细胞所需的营养物质尚未全部研究清楚，因此在使用合成培养基时需要加入血清等一些天然成分。培养动物细胞一般用液体培养基也称为培养液。

4.由于在体外培养细胞时，必须保证无菌无毒，即需要对培养液和所有培养用具进行灭菌处理，以及在无菌环境下操作培养液，还需要定期更换，以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。

5.哺乳动物细胞培养的温度多以36.5加减0.50C为宜，多数动物细胞生存的PH适宜为7.2-7.4。

6.动物细胞培养所需气体主要有O2和CO2，CO2的主要作用是维持培养液的PH。在进行细胞培养时，通常采用培养皿或松盖培养瓶，并将它们置于含有95%空气和5%的CO2的混合气体在CO2培养箱中进行培养。

7.在进行细胞培养时，首先对动物组织用机械的方法或胰蛋白酶，胶原蛋白酶处理一段时间，将组织分散成单个细胞，然后用培养液将细胞制成细胞悬液，再将细胞悬液放入培养皿或培养瓶类，置于适宜环境中培养。

8.体外培养的动物细胞可以分为两大类，一类细胞能够悬浮于培养液中生长增殖，另一类需要贴附于某些基质表面才能生长增殖，大多数细胞属于这种类型，这种类型细胞往往贴附在培养瓶的甁壁上，这种现象称为细胞贴壁。

9.贴壁生长的细胞在生长增殖时会发生接触抑制现象，即当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖，这时需要对细胞进行分瓶培养，让细胞继续增殖。

10.人们通常将分瓶之前的细胞培养及动物组织经处理后的初次培养称为原代培养，将分瓶后的细胞培养称为传代培养。

11.在进行传代培养时，悬浮培养的细胞直接用离心法收集。贴壁细胞需要重新用胰蛋白酶处理，使之分散为单个细胞，然后再用离心法收集。

12.动物细胞培养和植物细胞培养的相同之处与不同点。

①培养基不同：植物细胞（固体培养基），动物细胞（液体培养基）。

②培养基的成分不同：动物细胞培养必须利用动物血清，植物组织培养则不需要，而需要加入植物生长激素。

③产物不同：植物组织培养最后一般得到新的植物个体，而动物细胞培养因为动物体细胞一般不能表达其全能性，因此得到的是只含同一种的细胞的一个细胞系（或者叫细胞群）。

④原理不同：植物组织培养的原理为植物细胞的全能性，动物细胞培养的原理为细胞的增殖。

⑤过程不同：植物组织培养的过程为脱分化和再分化，动物细胞培养的过程为原代培养和传代培养。

⑥培养目的不同：植物组织培养是为了快速繁殖和获得无病毒植株，动物细胞培养是获得生物制品。

13.干细胞存在于早期胚胎骨髓和脐带血等多种组织和器官中，包括胚胎干细胞和成体干细胞。

14.胚胎干细胞简称ES细胞，存在于早期胚胎中，具有分化成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。

15.诱导多能干细胞简称iPS细胞iPS细胞治疗了小鼠的镰状细胞贫血，还可以治疗阿尔茨海默症，心血管疾病等。

16.动物细胞融合技术就是使两个或多个细胞结合，形成一个细胞的技术融合后形成的杂交细胞，具有原来两个或多个细胞的遗传信息。

17.动物细胞融合与植物细胞原生质体融合的基本原理相同，诱导动物细胞融合的常用的方法是PEG融合法，电融合法和灭活病毒诱导法等。

18. 灭活是指用物理或化学手段，使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏他们的抗原结构。

19.早期为了获得抗体，就向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离抗体，这种方法制备抗体，不仅产量低，纯度低，而且特异性差。

20.单克隆抗体的制备过程：让注射过特定抗原得到的一种B淋巴细胞，在体外与大量增殖的骨髓瘤细胞融合产生多种杂交瘤细胞。

21.用特定选择培养基进行筛选，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。对经选择培养的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选就可以得到足够数量的能分泌所需抗体的细胞，再将抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞在体外条件下大规模培养或者注射到小鼠腹腔内增殖，就可以获得大量的单克隆抗体。

22.单克隆抗体的优点是特异性强，灵敏度高，可大量制备。

23.抗体—药物偶联物ADC，通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性*伤，ADC通常由抗体、接头和药物三部分组成。

24.细胞核移植技术是将动物一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中，使这个重新组合的细胞发育成新胚胎，既而发育成动物个体的技术。

25.哺乳动物核移植可以分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植。

26.MⅡ期卵母细胞中的“核”，其实是纺锤体-染色体复合物，去“核”是除去该复合物。

27.体细胞核移植流程：取动物卵巢，并将其在体外培养到MⅡ期，通过显微操作去核，将高产供体细胞注入到去核的卵细胞。通过电融方法使两细胞融合，供体核进入卵母细胞，形成重构胚。用物理或化学方法，激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育进程，再将胚胎移入受体母牛体内。

28.重构胚是指人工重新构建的胚胎，具有发育成完整个体的能力。

29.目前，动物细胞核移植技术中普遍使用的去核方法是显微操作法。也有人采用梯度离心，紫外线短时间照射和化学物质处理等，这些方法没有穿透卵细胞透明带的情况下去核或使其中的DNA变性。

第二章第三节胚胎工程

1.胚胎工程是指对生殖细胞受精卵或早期胚胎细胞进行多种显微操作和处理，然后将获得的胚胎移植到雌性动物体内，产生后代以满足人类的各种需求。胚胎工程技术包括体外受精，胚胎移植和胚胎分割等。

2.受精是精子和卵子结合形成合子的过程，包括受精前的准备阶段和受精阶段。在自然条件下，哺乳动物的受精是在输卵管内完成。

3.准备阶段1一精子获能：使精子获能的方法有直接利用雌性动物的生殖道，使精子获能，或将精子培养在人工配制的获能液中，使其获能等。

4.准备阶段2—卵子的准备：卵子要在输卵管内进一步成熟到MⅡ期，才具备与精子受精的能力。

5.受精阶段：获能后的精子与卵子相遇时，首先释放出多种酶，以溶解卵细胞膜外的一些结构，同时借助自身的运动接触卵细胞膜。在精子触及卵细胞膜的瞬间，卵细胞膜外的透明带迅速发生生理反应，阻止后来的精子进入透明带，然后精子进入卵内。

6.阻止精子进入卵的两道屏障，一是透明的反应，二是卵细胞膜反应。

7.精子入卵后，尾部脱离原有的核膜破裂，并形成一个新的核膜，最后形成一个比原来精子的核还大的和叫做雄原核，与此同时，精子入卵后被激活的卵子完成MⅡ期，排出第二极体后，形成雌原核。

8.雄，雌原核充分发育后，彼此靠近，核膜消失，这个含有两个染色体组的合子就是受精卵。

9.受精的标志是观察到两个极体或观察到雌、雄原核。

10.受精卵在输卵管内进行有丝分裂，细胞的数量不断增加，但胚胎的总体积并不增加，这种受精卵的早期分裂称为卵裂。

11.当卵裂产生的子细胞逐渐形成致密的细胞团，形成桑葚时，这时的胚胎称为桑椹胚。

12.胚胎进一步发育，细胞逐渐分化，聚集在胚胎一端的细胞形成内细胞团，将来发育成胎儿的各种组织，而沿透明带内壁扩展和排列的细胞称为滋养层细胞，他们将来发育成胎膜和胎盘。

13.随着胚胎的进一步发育，胚胎的内部出现了含有液体的腔——囊胚腔，这个时期的胚胎叫做囊胚。囊胚进一步扩大，会导致透明带破裂，胚胎从其中伸展出来，这个过程叫孵化。

14.囊胚孵化后将发育形成原肠胚，原肠胚表面的细胞为外胚层，向内迁移的细胞形成内胚层，随着发育的进行，一部分细胞还会在内外两个胚层之间形成中胚层；这三个胚层将逐渐分化，形成各种组织器官等。

15.胚胎早期发育的过程简单说就是受精卵进行卵裂，到致密细胞团形成桑椹胚，出现囊胚腔形成囊胚，分化为三个胚层形成原肠胚。

16.胚胎干细胞细胞体积较小，但是细胞核较大。

17.试管牛，试管羊，首先要做的就是体外受精，哺乳动物体外受精，技术主要包括卵母细胞的采集，精子的获取和受精等步骤。

18.采集到的卵母细胞和精子要分别在体外进行成熟培养和获能处理，然后才能用于体外受精。

19.体外受精技术是提高动物繁殖能力的有效措施，还可以为胚胎移植提供可用的胚胎。

20.胚胎移植是指通过体外受精及其他方式得到的胚胎，移植到同种的生理状态相同的雌性动物体内使之继续发育为新个体的技术。

21.提供胚胎的个体称为供体，接受胚胎的个体叫受体。通过转基因，核移植和体外受精等获得的胚胎，都必须移植给受体才能获得后代。

22.胚胎移植主要包括供体，受体的选择和处理，配种或人工授精，胚胎的收集，检查，培养或保存，胚胎的移植以及移植后的检查等步骤。

23.进行胚胎移植的优势可以充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力。

24.胚胎分割是指采用机械方法将早期胚胎切割成二等份，四等份或八等份等，经移植获得同卵双胎或多胎的技术。

25.来自同一胚胎的后代具有相同的遗传物质，因此胚胎分割可以看作动物无性繁殖或克隆的方法之一。

26.超数排卵是指应用外源促性腺激素，诱发卵巢排出比自然情况下更多的成熟卵子。

27.胚胎分割所需要的主要仪器设备为体视显微镜和显微操作仪，在进行胚胎分割时，应选择发育良好，形态正常的桑椹胚或囊胚，将它移入盛有操作液的培养皿中，然后再显微镜下用分割针或分割刀分割。

第三章基因工程第一节

1.基因工程操作至少需要三种分子工具，既准确切割DNA分子的“分子手术刀”，将DNA片段再连接起来的“分子缝合针”和将体外*好的DNA分子导入受体细胞的“分子运输车”。

2.限制性内切核酸酶——分子手术刀。切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶简称限制酶，这种酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。它能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键切开。

3.大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，例如EcoRⅠ、SmaⅠ限制酶的识别序列均为6个核苷酸，也有少数限制酶的识别序列由4个，8个或其他数量的核苷酸组成。

4.DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式，黏性末端和平末端。

5.将切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子，是靠DNA连接酶来完成的。

6.在基因工程操作中，DNA连接酶主要有两类，一类是从大肠杆菌中分离得到的，称为E.coli DNA连接酶，另一类是从T4噬菌体中分离出的，称为T4 DNA连接酶。

7.基因进入受体细胞的载体——分子运输车。通常利用质粒作为载体，将基因送入细胞，质粒是一种裸露的，结构简单，独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。

8.质粒DNA分子上有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入其中。

9.基因工程操作中的质粒常常有特殊的标记基因，如四环素抗性基因，氨苄青霉素抗性基因等，便于*DNA分子的筛选。

10.基因工程中使用的载体除质粒外，还有噬菌体动植物病毒等。

11.DNA不溶于酒精，但是某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理可以初步分离DNA与蛋白质。

12.DNA在不同浓度的氯化钠溶液中溶解度不同，它能溶于2mol/L氯化钠溶液。

13.在水浴加热条件下，DNA与二苯胺试剂会呈现蓝色。

第三章第二节基因工程的基本操作程序

1.培育转基因抗虫棉主要需要四个步骤，目的基因的筛选与获取，基因表达载体的构建，将目的基因导入受体细胞，目的基因的检测与鉴定。

2.在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。

3.苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白—Bt抗虫蛋白，*死棉铃虫。

4. 用PCR获取和扩增目的基因。PCR是聚合酶链式反应的缩写，它的原理是DNA半保留复制，它是一种体外快速扩增DNA的技术。

5.PCR体外复制DNA的基本条件：控制温度，使DNA复制在体外反复进行；提供DNA复制的模板；以四种脱氧核苷酸为原料；以耐高温的DNA聚合酶催化合成子链；需要两种引物，使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸；需要在一定的缓冲溶液中才能进行。

6.真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2 激活，因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2 。

7.引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20到30个核苷酸。

8.扩增的过程是：目的基因DNA受热变性后解为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后以单链DNA为模板，在DNA聚合酶作用下进行延伸，即将四种核苷酸加到引物的3’端，如此重复循环多次。

9.PCR循环一般分为变性（温度超过900C），复性（温度下降到500C左右），延伸（温度上升到720C左右）。

10.PCR的产物鉴定常用琼脂糖凝胶电泳。

11.基因表达载体的构建：基因表达载体是载体的一种，除目的基因，标记基因外，它还必须有启动子，终止子等。

12.启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动动基因转录出信使RNA，最终表达出人类需要的蛋白质。

13.终止子相当于一盏红色信号灯，它位于基因的下游，也是一段有特殊序列结构的DNA片段。

14.在构建抗虫棉的基因表达载体时，首先会用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口，然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段，再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，这样就形成了一个*DNA分子。

15.将目的基因导入受体细胞：可以用花粉管通道法，用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；还可以在植物授粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。

16.目的基因导入植物的方法，除花粉管通道法，还有农杆菌转化法。

17.转化是指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

18.农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T—DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。

19.目的基因的检测与鉴定：首先是分子水平的检测，包括通过PCR等技术检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因是否转录出信使RNA；从转基因棉花中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原——抗体杂交，检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白等。其次，还需要进行个体生物学水平的鉴定。例如，通过采摘抗虫棉的叶片是为棉铃虫来确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度。

20.基因工程操作步骤简单来说，就是获取质粒，噬菌体等载体，筛选和获取目的基因，用限制酶切割载体和含有目的基因的DNA片段，然后用DNA连接酶连接，构建基因表达载体，将有目地的表达载体导入受体细胞，检测和鉴定目的基因是否稳定，维持和表达其遗传特性。

21.将目的基因导入动物受精卵的一种最常用的方法是利用显微注射将目的基因注入动物的受精卵中。在基因工程操作中，常用原核生物作为受体细胞。其中，以大肠杆菌应用最为广泛，研究人员一般先用Ca2 理大肠杆菌细胞，使细胞属于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将*的基因表达载体导入其中。

22.转基因抗虫棉有效控制了棉铃虫的种群，数量显著减少了农药的用量。

23.基因工程在农牧业，医药卫生和食品工业等方面有广阔的应用前景。

第三章第四节蛋白质工程的原理和应用

1.蛋白质工程是以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。

2.将一种生物的基因转移到另外一种生物体内，后者可以产生他本不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状，这就是基因工程的实质。基因工程原则上只能生产自然界中的存在的蛋白质。

3.蛋白质工程的目标是根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造，由于基因决定蛋白质，因此要对蛋白质的结构进行设计改造，最终还必须通过改造或合成基因来完成。发

4.蛋白质工程的基本思路，从预期的蛋白质的功能出，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到并改变相应的脱氧核苷酸序列或合成新的基因，从而获得所需要的蛋白质。

5.蛋白质工程是基因工程的延伸，是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因来改造现有的蛋白质或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产生活的需求。

6.蛋白质工程在农业，医药工业及其他工业生产中有很大的应用价值。