研究一个蛋白质的第一步是拿到它准确的基因序列，有了基因序列，我们就可以构建合适的质粒，表达出所需要的蛋白。
质粒构建，英文名为plasmid construction。选定的目的外源基因（DNA）先要经过PCR扩增。随后用限制性内切酶分别切割载体和外源DNA片段，再使用DNA连接酶将切割后的载体与DNA片段连接，转入宿主细胞。最后经过筛选鉴定出正确的*克隆质粒，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。
图一：质粒构建流程示意图
1、如何选择载体？
载体通常分为克隆载体（Cloning Vector）与表达载体（Expression Vectors）两种。
克隆载体大多是高拷贝载体，能够将外源基因与克隆载体的质粒连接，导入原核细菌内，进行大量复制克隆。主要用途是保存目的基因片段。
在选择克隆载体时应注意：
① 具有自主复制能力，拷贝数高；
②携带易于筛选的选择标记；
③含有多种限制酶的单一识别序列，以供外源基因插入；
④载体应尽可能小（＜15kb），便于导入细胞和进行繁殖；
⑤使用安全。克隆载体应只存在于有限范围的宿主内，在宿主体内不进行*，不发生转移，不产生有害性状，并且不能离开工程宿主自由扩散。
表达载体是为了使插入的外源DNA序列转录、翻译成多肽链而进行特殊设计的克隆载体。它含有特定的表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号。
根据表达的类型，表达载体可分四类：
非融合型表达载体，如PKK223-3；
分泌型表达载体，如PINⅢ-ompA1；
融合蛋白型表达载体，如PGEX；
包涵体型表达载体，如pBV220。
图二：基因片段选择
2、引物设计中的规则
运用PCR扩增目的基因的过程中，引物设计十分关键，以下是需要注意的：
① 引物长度最好在18-30bp左右，常用的长度是 20-22bp；
②引物 Tm 值最好在 60℃ 左右，两条引物间 Tm 值要保持接近，相差最好不要超过 5°C；
③GC 的含量标准通常为 40%-60% 或45-55%；
④引物自身不应含有连续超过4个的互补的碱基，避免形成发卡结构或形成引物二聚体；
⑤引物的3' 端要避免出现连续重复的碱基，如 GGG 或 CCC ，这会导致错配的发生，最后一个碱基最好是 G 或 C；
⑥在引物的 5′ 端添加酶切位点时（在不影响扩增的特异性的前提下），根据酶切位点序列，需要添加不同种类和数量的保护碱基，通常多加3个碱基即可满足保护酶切位点的需求；
⑦上下游引物最好加入不同的酶切位点，相同的酶切位点可能导致目的基因片段出现倒置连接现象，影响基因序列的正常表达。
3、PCR扩增中常见的问题
扩增基因的过程并不困难，但未必能保证百分之百的成功率。
如结果出现引物二聚体、非特异性条带（大小不对）的现象，可以通过降低模板和引物的浓度、降低镁离子浓度、适当减少酶量，提高退火温度，来提高扩增特异性。
若出现凝胶条带弥散状态，多为模板不纯、反应体系中各成分比例不合适、退火温度设置偏低、循环次数过多等原因。
长片段基因的扩增容易增加点突变和错配率，选用高扩增能力、高保真、可靠性强的聚合酶也很关键。
4、其他问题
在操作酶切连接的步骤时也要定性定量，保证酶活性充足，例如：双酶切尽可能选择同种缓冲buffer，一般用量40U单位以上（用量不超过总体积1/10），保证酶切过程充分；可根据 目标片段量（ng）=(载体量（ng）×目标片段长度（kb）)/(载体DNA片段长度（kb）)×目标片段和载体的摩尔比（1：3-1：8）计算出目标片段和载体的加入量，提高连接效率。
构建好的载体放入感受态细胞中转化（TOP10、DH5α、BL21等，感受态细胞在使用时尽可能保证新鲜，避免反复冻融，冰上孵育和热激时间应严格控制），经抗性、菌落PCR、酶切、测序等多道程序验证，确定是否转化成功，最终获得正确的*克隆基因片段。
5、如何选择正确的菌株和载体（详见文末列表）
公司简介
「青云瑞晶」是一家专业的CRO（研发服务提供商）。公司拥有高标准的实验室、先进的设备，和丰富经验的博士硕士研究人员，在结构生物学，药物固态研究和新材料结构表征，三个业务板块，为客户提供最先进的解决方案。
公司自主开发了国际领先的MicroED结构解析平台，结合冷冻电镜单颗粒（CryoEM-SPA）及同步辐射单晶X射线衍射（XRD），为客户解决难点问题。
E coli strain list
No. | strain | annotation | Resistant |
1 | BL21 (DE3) | 最常用的 | No |
2 | Rosetta (DE3) | 稀有密码子AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA | Cl |
3 | Rosetta2 (DE3) | 稀有密码子AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA和CGG | Cl |
3 | Origami 2 (DE3) | 二硫键及稀有密码子 | StrR，Tet |
4 | C41 (DE3)orC43 (DE3) | 疏水性蛋白 | No |
5 | Arctic (DE3) | TPN30 & TPN60 分子伴侣 | Tet，Cam |
6 | Tuner(DE3) | 通过IPTG精确控制表达量, 0.1mM IPTG | No |
7 | BL21 (DE3) pLysS | 降低毒性蛋白的本底表达 | Cl |
8 | Rosetta(DE3) pLysS | 降低毒性蛋白的本底表达,稀有密码子AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, 和GGA。 | Cl |
9 | BL21(DE3) del-slyXD | BL21(DE3) knock out slyXD | No |
10 | B834(DE3) | Met缺陷菌株 | No |
11 | T7 pLys Y | 具有抗T1噬菌体感染能力 | Cl |
12 | BL21star(DE3) | ||
13 | origamiB(DE3) | 二硫键 | KanR,TetR |
14 | Origami 2 (DE3) pLysS | Origami 2 (DE3)的基础上加pLysS抑制本地表达。 | Cl，StrR，Tet |
15 | Dh5α | 克隆菌株 | No |
16 | Dh5α-T1 | 具有抗T1噬菌体感染能力 | No |
17 | Dh10bac | Bacmid 制备 | Tet,gentamicin |
18 | BL21-Gold(DE3) | 可以同时用作蛋白表达菌株和质粒克隆菌株 | No |
Plasmid list
名称 | 长度 | 抗性 | 特殊性能 |
PAO815 | 7709 bp | Amp | 酵母表达 |
pAxCAwt | 44741 bp | Amp | 腺病毒表达 |
pAxcw | 42410 bp | Amp | 腺病毒表达 |
pAAV-MCS | 4.7 kbp | Amp | 哺乳动物细胞表达 |
pBacPAK8 | 5.5 kbp | Amp | 杆状病毒表达 |
PBI121 | 13.0 kbp | Kan | 植物细胞表达 |
pBV220 | 3665 bp | Amp | 原核表达 |
pCAMBIA 1300 | 植物细胞表达 | ||
pCAMBIA 1301 | 11837 bp | Kan | 植物细胞表达 |
pCAT3-Basic | 4047 bp | Amp | |
pcDNA 3 | 5446 bp | Amp | 哺乳动物细胞表达 |
pcDNA 3.1( ) | 5428 bp | Amp | 哺乳动物细胞表达 |
pcDNA 3.1/ mys-HisA | 5494 bp | Amp | 哺乳动物细胞表达 |
pCl-neo | 5472 bp | Amp | 哺乳动物细胞表达 |
pCMV-MCS | 4.5 kbp | Amp | 哺乳动物细胞表达 |
pET-3a | 4640 bp | Amp | 大肠杆菌表达 |
pET-11a | 5677 bp | Amp | 大肠杆菌表达 |
pET-15b( ) | 5708 bp | Amp | 大肠杆菌表达 |
pET-20b( ) | 3716 bp | Amp | 大肠杆菌表达 |
pET-22b( ) | 5493 bp | Amp | 大肠杆菌表达 |
pET-23a( ) | 3666 bp | Amp | 大肠杆菌表达 |
pET-23b( ) | 3665 bp | Amp | 大肠杆菌表达 |
pET-23c( ) | 3664 bp | Amp | 大肠杆菌表达 |
pET-23d( ) | 3663 bp | Amp | 大肠杆菌表达 |
pET-28a( ) | 5369 bp | Kan | 大肠杆菌表达 |
pET-28b( ) | 5368 bp | Kan | 大肠杆菌表达 |
pET-28c( ) | 5367 bp | Kan | 大肠杆菌表达 |
pET-30a( ) | 5422 bp | Kan | 大肠杆菌表达 |
pET-30b( ) | 5421 bp | Kan | 大肠杆菌表达 |
pET-30c( ) | 5423 bp | Kan | 大肠杆菌表达 |
pET-31b( ) | 5742 bp | Amp | 大肠杆菌表达 |
pET-32a( ) | 5900 bp | Amp | 大肠杆菌表达 |
pET-32b( ) | 5899 bp | Amp | 大肠杆菌表达 |
pET-32c( ) | 5901 bp | Amp | 大肠杆菌表达 |
pET-39b | 6106 bp | Kan | 大肠杆菌表达 |
pET-42a | 5930 bp | Kan | 大肠杆菌表达 |
pGAPZ-aA | 3147 bp | Zeo | 酵母表达 |
pGBKT7 | 7.3 kbp | Kan | 酵母表达 |
pGEM3Zb | 原核表达 | ||
pGEM3Zf( ) | 原核表达 | ||
pGEM7Zf( ) | 原核表达 | ||
pGEX-2T | 4969 bp | Amp | 原核表达 |
pGEX-4T-1 | 4969 bp | Amp | 原核表达 |
pGFP-N2 | 4732 bp | Kan | 哺乳动物细胞 荧光蛋白表达 |
pEGFP-C1 | 4731 bp | Kan | 哺乳动物细胞 荧光蛋白表达 |
pEGFP-C3 | 4727 bp | Kan | 哺乳动物细胞 荧光蛋白表达 |
pEGFP-N1 | 4733 bp | Kan | 哺乳动物细胞 荧光蛋白表达 |
pLEGFP-N1 | 6892 bp | Amp | 哺乳动物细胞 荧光蛋白表达 |
pGL3-Basic | 4818 bp | Amp | |
pGL36 | |||
pLNCX | 6620 bp | Amp | 反转录病毒表达 |
pLNHX | 5.6 kbp | Amp | 反转录病毒表达 |
pLXSN | 5.9 kbp | Amp | 反转录病毒表达 |
pLXIN | 6.1 kbp | Amp | 反转录病毒表达 |
pMAL-p2x | 6721 bp | Amp | 原核融合蛋白表达 |
pMAL-c2x | 6721 bp | Amp | 原核融合蛋白表达 |
pPIC3.5K | 9004 bp | Amp/Kan | 酵母表达 |
pPIC9 | 8024 bp | Amp | 酵母表达 |
pPIC9K | 9276 bp | Amp | 酵母表达 |
pPICZ aA | 3593 bp | Zeo | 酵母表达 |
pQBI PGK | 5387 bp | Amp | 哺乳动物细胞 荧光蛋白表达 |
pQE-30 | 3461 bp | Amp | 原核表达 |
pQE-9 | 3439 bp | Amp | 原核表达 |
pRevTRE | 6487 bp | Amp | 反转录病毒表达 |
pSE420L | 4617 bp | Amp | |
pTac I | Amp | 原核表达 | |
pTac I(BamH I) | Amp | 原核表达 | |
pTAL-Luc | 4956 bp | Amp | 哺乳动物细胞表达 |
pTWIN1 | 7375 bp | Amp | |
pTXB1 | 6706 bp | Amp | |
pVAX1 | 2999 bp | Kan |
