一、无菌操作要求

微生物实验室工作人员，必须有严格的无菌观念，许多实验要求在无菌的条件下进行，主要原因，一是防止试验操作中人为污染样品，二是保证工作人员安全，防止检出的致病菌由于操作不当造成个人污染。要求如下：

1.1 接种细菌时必须穿工作服、带工作帽；

1.2 进行接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用；

1.3 接种食品样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用酒精棉球将手擦干净；

1.4 进行接种所用的吸管、平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用酒精点燃烧灼三次后使用；

1.5 从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及试管或平皿边；

1.6 接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌活样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒；

1.7 接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到针和环与杆的连接处，接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸5min，再经火焰烧灼；

1.8 吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。

二、无菌间使用要求

2.1 无菌间应密封，不得随意打开，并设有与无菌间大小相应的缓冲间及门，另尽量设有的小窗，以备进入无菌间后传递物品。

2.2 无菌间应保持清洁，工作后用煤酚皂液溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与试验无关的物品；

2.3 无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯，如采用室内悬掉紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离工作台1m处，照射时间不少于30分钟，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精球轻轻擦拭，除去上面的灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响；

2.4 处理和接种食品标本时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递；

2.5 在无菌间需用安装空调时，则应有过滤装置。

三、消毒灭菌要求

微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等，必须经灭菌后方能使用。

3.1 灭菌前准备

3.1.1 所有需经灭菌的物品首先要清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用纸包装严密，如用金属筒应将上面气孔打开。

3.1.2 装培养基的三角瓶塞好棉塞，用纸包好，试管盖好盖，注射器须将管芯抽出，用纱布包好。

3.2 装放

3.2.1 大型高压蒸气锅：放置灭菌物品不应超过锅内容积的80%，物品应放置锅内搁架上或铁丝筐中。

3.2.2 手提式高压锅：将物品分别包扎好，直接放入消毒筒内，物品之间不能过挤。

3.3 设备检查

3.3.1 检查门的开关是否灵活，橡皮圈有无损坏，是否平整。

3.3.2 压力表蒸气排尽时是否停留在零位，关好门和盖，通蒸气或加热后，观察是否漏气，压力表与温度计所标示的状况是否吻合，管道有无堵塞。

3.3.3 对有自动电子程序控制装置的灭菌器，使用前应检查规定的程序，是否符合于进行灭菌处理的要求。

3.4 灭菌处理

手提式高压锅或立式压力蒸气灭菌器的使用应按下列步骤进行：

3.4.1 手提式高压锅在主体内加入3L清水，立式高压锅加水16L（重复使用时应将水量补足，水变混浊需要更换）。

3.4.2 手提式压力锅将顶盖上的排气管插入消毒桶内壁的方管中（无软管或软管锈蚀破裂的灭菌器不得使用）。

3.4.3 盖好顶盖拧紧，勿使漏气；置灭菌器于火源上加热，立式压力锅通上电源，并打开顶盖上的排气阀放出冷气（水沸腾后排气10～15min）。

3.4.4 关闭排气阀，使蒸气压上升到规定要求，并维持规定时间（按灭菌物品性质与有关情况而定）。

3.4.5 达到规定时间后，对需干燥的物品，立即打开排气阀排出蒸汽，待压力恢复到零时，自然冷却至60℃后开盖取物，如为液体物品，不要打开排气阀，而应立即将锅去除热源，待自然冷却，压力恢复至零，温度降到60℃以下再打开盖取物，以防止突然减压液体剧烈沸腾活容器爆破。

3.5 灭菌温度与时间

3.5.1压力蒸气灭菌锅灭菌温度与时间见下表：

3.5.2 灭菌处理：灭菌后物品，剂等，应检查是否符合达到灭菌后的色泽或状态，未达到者应废弃。

3.5.3 取出的物品掉落在地或误放不洁之处，或沾有水液，均视为受到污染，不可作为无菌物品使用。

3.5.4 取出的合格灭菌物品，应存放于贮藏室或防尘柜内，严禁与未灭菌物品混放。

3.5.5 凡属合格物品，应标有灭菌日期及有效期限。

3.5.6 每批灭菌处理完成后，记录灭菌品名、数量、温度、时间、操作者。

四、有毒有菌污物处理要求

微生物实验室所用实验器材、培养物等未经消毒处理，一律不得带出实验室。

4.1 经培养的污染材料及废弃物应放在严密的容器或铁丝筐内，并集中存放在指定地点，待统一进行高压灭菌。

4.2 经微生物污染的培养物，必须经121℃，30min高压灭菌。

4.3 染菌后的吸管，使用后放入5%煤酚皂溶液或石炭酸溶液中，最少浸泡24小时，再经121℃，30min高压灭菌。

4.4 涂片染色冲洗片的液体，一般可直接冲入下水道，染色的玻片放入5%煤酚皂液中浸泡24h后，煮沸洗涤。做凝集试验用的玻片或平皿，必须经高压灭菌后洗涤。

4.5 打碎的培养物，立即用5%煤酚皂液或石炭酸喷洒和浸泡被污染部位，浸泡半小时后再擦拭干净。

4.6 污染的工作服或进行烈性菌试验所穿的工作服、帽、口罩等，应放入专用消毒袋内，经高压灭菌后方能洗涤。

五、玻璃器皿的清洗要求

5.1 目的

为了保证微生物实验顺利进行，保证实验结果的准确性，不影响实验进度，必须把器皿彻底清洗干净。

5.2 注意事项

5.2.1 任何洗涤方法，都不应对玻璃器皿有所损伤，不能用有腐蚀作用的化学药剂，也不能使用比玻璃器皿硬度大的物品来擦拭玻璃器皿。

5.2.2 一般新的玻璃器皿用2%的盐酸液浸泡数小时，后用水冲洗干净。

5.2.3 用过的器皿应立即洗涤，放置太久会增加洗涤困难。

5.2.4 强酸、强碱及其它氧化物和有挥发性的有毒物品，都不能倒在洗涤槽内，以免污染环境水质，必须倒在废水缸中。

5.2.5 含有对人体有传染性病菌的器具，应先煮沸灭菌后再进行洗涤。

5.2.6 难洗涤的器皿不要与易洗涤的器皿放在一起，以免增加洗涤的麻烦。有油的器皿不要与无油的器皿混在一起，否则使本来无油的器皿沾上了油垢，浪费药剂和时间。

5.3 洗涤剂的种类：

水、洗衣粉、柠檬洗涤剂、肥皂

5.4 洗涤方法

5.4.1 含有琼脂培养基的玻璃器皿的洗涤方法：事先应将器皿中的琼脂刮去，然后用清水洗涤，并用试管刷刷其瓶壁，以除去粘污在壁上的灰尘和油垢。用洗衣粉水洗去油污，然后用自来水冲洗。洗好后的器皿应倒置晾干或置于干燥箱中干燥至无水滴。

5.4.2 载玻片及盖玻片的洗涤法：新载玻片及盖玻片先在20%的盐酸溶液中浸一小时，然后用自来水冲洗2~3次，最后用蒸馏水换洗2~3次。用过的载玻片及盖玻片，应用纸擦去油垢，再放在5%的洗衣粉水中煮30分钟后立即用自来水冲洗，然后放在稀的洗液中浸泡2小时，再用自来水冲洗至中性。

5.4.3 移液管、倒管的洗涤方法：新的移液管及倒管先在的５％盐酸溶液中浸一小时，然后用自来水冲洗几次，最后用蒸馏水换洗几次。用过的移液管、倒管先用自来水洗去表面的残液，再放在洗衣粉水中浸泡一小时以上，再用自来水冲洗至管内壁无残渣，最后用蒸馏水换洗次，晾干后入恒温干燥箱中烘干。

六、培养基、无菌水的制备

6.1 基本原理

培养基的种类很多，不同微生物所需要的培养基不同。培养基制成后的物理状态可分为液体、固体、半固体三种类型。

6.2 器材

三角瓶、试管、烧杯、玻棒、天平、搪瓷杯、量筒、铝箔纸、角匙、杜氏小管、硅胶塞、电炉

6.3 培养基的种类

营养琼脂培养基、乳糖胆盐发酵培养基、乳糖发酵培养基、伊红美兰琼脂培养基、马铃薯-葡萄糖琼脂培养基(附加抗菌素)、平板计数琼脂、月桂基硫酸盐胰蛋白冻肉汤、煌绿乳糖胆盐肉汤、EC肉汤、高盐察氏琼脂、三糖铁琼脂等

6.4 方法步骤

6.4.1 培养基的制备：

6.4.2 称量：根据培养基的配方，称取适量药品于搪瓷杯中；

6.4.3 溶解：用量筒量取所需水量，置电炉上加热，一边搅拌，至完全溶解，加热至沸腾，拔掉电源，待冷却；

6.4.4 分装：根据不同需要，立即趁热分装入三角瓶或试管中，分装三角瓶以不超过三角瓶一半为宜，分装试管一般为管长的1/5（需根据试管的大小而定）。液体培养基如乳糖胆盐发酵培养基约分装10毫升左右。

6.4.5 塞硅胶塞：装好培养基的试管应塞上硅胶塞，松紧合适，紧贴管壁，不留缝隙，约1/2塞入内，这样即可过滤空气，避免杂菌侵入，又可减缓培养基水分的蒸发。

6.4.6 包装：三角瓶棉塞头部应用锡箔纸包扎，试管集中于试管篓。

6.5 无菌水的制备：

6.5.1 用10ml移液管量取9.2ml蒸馏水（稀释水）装入试管中。

6.5.2 用100ml量筒量取95ml蒸馏水（稀释水）装入150ml的三角瓶中。可置少许玻璃珠于三角瓶内，防止暴沸。

6.5.3 量取240ml蒸馏水（稀释水）于250ml的三角瓶中，塞上瓶塞用牛皮纸包扎好，高压灭菌备用。

七、设备使用原则

7.1 实验设备的使用由实验员严格按照操作说明书进行，其他人员不得随意操作。

7.2 实验设备的日常维护保养由实验员根据设备操作说明书进行，出现不可排除的故障时，经部门总经理批准，商请专业人员维修。

7.3 实验设备应定期进行计量检测，确保仪器的准确性。

7.4 实验员应爱护仪器设备，使用前应检查，使用后应及时清理清洁，并定期维护保养，下班前应检查设备电源是否关闭。