克隆载体的选择

理想的大肠杆菌表达载体应该具有以下几个特征：① 要有外源基因插入所需要的酶切位点。② 启动子应该是可以调控的，以便于抑制本底转录。③ 要有筛选标记基因，如抗生素抗性基因等。④ 具有稳定的遗传复制及传代能力。⑤ 要有终止子，使得目的基因的转录能够在适当的时候停止，而不会通读下游基因读码框。由于各种表达载体都不是完美的，因此为了满足需要，各种类型的表达载体相继出现，目前常用的表达载体有以下几种：

1. pGEX系列载体

该系列载体利用tac启动子，在tac启动子和多克隆位点之间插入了两个有利于纯化的编码序列，其一是谷胱甘肽巯基转移酶基因，其二是编码凝血蛋白酶或者Factor Xa因子（简称Xa因子）切割位点的序列。这样，外源基因表达时会表达出编码三个序列的融合蛋白，便于使用亲和层析纯化，然后再用凝血蛋白酶或者Xa因子切割融合蛋白。此外，该系列载体上有一个lacIq基因，能够表达更多的阻遏蛋白以实现严谨的诱导调控。总之，该系列载体的优点就是使用GST标签表达融合蛋白，并增加了外源蛋白的溶解度，可以说，该系列载体是一个大众型载体，目前也比较常用。

2. pBV220 系列载体

该系列载体的SD序列后面紧跟着就是多克隆位点，便于带有起始密码子ATG的外源基因的插入并表达成非融合蛋白。其含有clts857基因（cl基因的温度敏感突变体），该基因表达的cl蛋白能够抑制启动子PR和PL,又对温度敏感，正因为如此，该系列载体可以用温度对外源基因的转录进行调控。但是该系列载体也存在缺点，在激活的过程中，大肠杆菌中的热休克蛋白也会表达，可能会降解表达的外源蛋白。

3. pQE系列载体

该系列载体有一个来自噬菌体的T5启动子和两个乳糖操纵子识别序列，确保与阻遏蛋白相结合以抑制T5启动子的表达。还有一个RBS，即核糖体结合位点，使其能够与核糖体结合并高效翻译。这类载体带有一个6×His标签，外源基因可以插入在标签的N端或者C端。此外，还有终止密码子能及时终止外源基因的转录，防止通读阅读框。

4. pMAL系列载体

该系列表达载体利用强tac启动子，有一个malE基因（编码麦芽糖结合蛋白），从而与外源蛋白形成融合蛋白，并且在这两个编码序列之间有切割位点，便于在纯化时使用Factor Xa或者凝集素蛋白酶等将外源蛋白从融合蛋白中切割下来。此外，其含有一个LacZ基因，利用外源基因插入失活的特点，可以进行蓝白斑筛选。这种载体可以使外源蛋白在细胞质或者细胞周质中表达，在细胞周质中表达可以促进二硫键的形成，利于蛋白质的正确折叠。

5. pET系列载体

pET系统是有史以来在大肠杆菌中克隆外源基因最为强大的表达系统。该系列载体利用强T7启动子或者T7lac启动子，转化宿主细胞以后在诱导物IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）诱导下几个小时内就可以大量表达外源基因，外源蛋白在宿主细胞中的比例可以高达50%以上。此外，该系列载体上有氨苄青霉素抗性基因或者卡那霉素抗性基因，便于筛选。

外源基因的诱导表达

将构建成功的外源基因表达载体甘油菌接种至含有相应抗生素的培养基中，在509的37℃恒温摇床上培养过夜，次日，按照1:100的比例转接至含有相应抗生素的新鲜培养基中，置于37℃摇床振荡培养一段时间后取出菌液测其OD600，至OD600达到0.4-0.6时，加入终浓度0.1~1 mM的IPTG，37℃或者设定其它的温度诱导4 h或者预设的时间。诱导结束后于4℃，12,000×g离心5 min，收集菌体。

外源基因的蛋白表达检测

菌体沉淀中加入若干体积4℃预冷的PBS，在冰水浴中超声波破碎菌体。超声破碎条件：工作5 sec，间歇10 sec，共20 min，功率400 w；将破碎后的菌体转移到离心管中，于4℃，12,000×g离心20 min，分离上清和沉淀。沉淀物中加入若干体积的PBS，充分重悬。上清和沉淀样品可直接用于制备蛋白电泳样品，进行SDS-PAGE分析或置于-20℃保存备用。

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