PCR扩增DNA时，怎么保证分开的双链就与引物结合

问题：PCR扩增DNA时，降温复性是让引物与分开的双链结合，这时怎么保证分开的双链就与引物结合而不是原来的两条母连彼此重新结合？

解释：原因有两个：
1.完全解链的两条母链自动复性需要时间长，需要10小时以上才能复性完全。
2.母链的复性需要缓慢冷却，如果是迅即冷却，则DNA仍然保持单链状态。

参考文献：①基因工程技术及应用②遗传学

相关高考题在线：

1.[2011年·江苏，33]请回答基因工程方面的有关问题：

(1)利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似（如下图所示）。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。

①从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为 。

②在第 轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。

(2)设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（如下图），请分别说明理由。

①第1组： ；

②第2组： 。

(3) PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为 。

(4)用限制酶EcoRV、Mbol单独或联合切割同一种质粒，得到的DNA片段长度如下图(1 kb即1000个碱基对)，请在答题卡的指定位置画出质粒上EcoRV、Mbol的切割位点。

【答案】

(1)①15/16 ②三

(2)①引物I和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效

②引物I’自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效

(3) DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNA片段的引物链上

(4)见右图

2.[2017年·全国III，38][生物——选修3：现代生物科技专题]（15分）

编码蛋白甲的DNA序列（序列甲）由A、B、C、D、E五个片段组成，编码蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段组成，如图1所示。

回答下列问题：

（1）先要通过基因工程的方法获得蛋白乙，若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列（TTCGCTTCT……CAGGAAGGA），则所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙，原因是________。

（2）某同学在用PCR技术获取DNA片段B或D的过程中，在PCR反应体系中加入了DNA聚合酶、引物等，还加入了序列甲作为________，加入了________作为合成DNA的原料。

（3）现通过基因工程方法获得了甲、乙、丙三种蛋白，要鉴定这三种蛋白是否具有刺激T淋巴细胞增殖的作用，某同学做了如下实验：将一定量的含T淋巴细胞的培养液平均分成四组，其中三组分别加入等量的蛋白甲、乙、丙，另一组作为对照，培养并定期检测T淋巴细胞浓度，结果如图2。

①由图2 可知，当细胞浓度达到a时，添加蛋白乙的培养液中T淋巴细胞浓度不再增加，此时若要使T淋巴细胞继续增殖，可采用的方法是_______。细胞培养过程中，培养箱中通常要维持一定的CO2浓度，CO2的作用是_______。

②仅根据图、图2可知，上述甲、乙、丙三种蛋白中，若缺少_______（填“A”“B”“C”“D”或“E”）片段所编码的肽段，则会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效果。

答案：

38.

（1） 编码乙的 DNA 序列起始端无ATG，转录出的mRNA无起始密码子

（2） 模板 dNTP

（3）①进行细胞传代培养 维持培养液的pH ② C

3.[2019年·全国卷I,38]【生物—选修3:现代生物科技专题】

基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。

（1）基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括 和 。

（2）生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是 。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是 。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的 。

（3）目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因 。

答案：

(1) 基因组文库 cDNA文库

(2) 解旋酶 加热至90-95℃ 氢键

(3)Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活