首先介绍一下荧光定量PCR引物设计原则：做完RNA seq测序想要验证基因表达上调下调，还是购买烧钱抗体做Western blot之前先验证一下关键基因的表达都离不来荧光定量PCR实验，这就需要又快又准的设计好Real time PCR引物，今天小编就分享一下如何利用NCBI设计PCR引物。
1、引物长度一般在15-30bp。常用的为18-27bp，但不应大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应；
2、引物GC含量一般为40%-60%， 45-55%为宜，GC含量过高或过低都不利于引发反应。上下游引物GC含量和Tm值要保持接近；
3、引物所对应的模板序列的Tm值最好在72℃左右。至少要在55-80℃之间。
4、引物3’端的碱基一般不用A。A在错误引发位点的引发效率相对比较高。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，或者引物3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。
5、碱基要随机分布，且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。
6、尽量在Exon junction上设计引物，限制基因组DNA扩增。
7、使用BLAST检索，确认引物特异性。
下面推荐Primer-BLAST在线引物设计网站https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/，这个网站可以在线设计用于聚合酶链反应（PCR）的特异性寡核苷酸引物,同时整合了Primer3和NCBI的Blast功能。那么如何使用Primer-BLAST呢？1. 假设我们要设计human p53引物，登陆PubMed https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed，选择Nucleotide, 输入p53 human mRNA（基因＋物种＋mRNA），单击Search。
左侧选择mRNA，出现的第一条就是human mRNA的序列，点击进入。
