我们创建了一个整合质粒，其中包含Pnmt1启动子（来自#4），C端GFP标签，kan选择标记（#8）和co20靶序列（#2），以表达Cut7与GFP的融合蛋白。

作为GOI（基因兴趣物），我们使用了野生型和cut31基因（10.7-1.2 kb）的3个截短突变体，总共进行了0次金门反应。

将每种反应样品用于大肠杆菌细胞的转化，并选择在LB Amp培养基上生长的一些菌落进行小规模制备，使用NotI酶对质粒进行消化以确认连接是否成功。

成功连接的比例为：11/1（三次反应）、1/1（一次反应）和2/3（七次反应），表明使用这些材料进行金门反应能够有效地产生正确的质粒。

在进行了三个金门样品的转化后，在LB Amp平板上观察到了30-150个转化的大肠杆菌菌落，选择了每个转化体中的5个菌落进行质粒小制备，并通过NotI酶切进行验证。

在这6个样品中，有2个、8个和1个分别显示出整合质粒〈2〉、〈3〉和〈1〉的正确连接，使用FseI酶对正确连接的整合质粒进行消化，并将线性化片段用于庞贝链球菌细胞的转化，以表达m樱桃微管蛋白或GFP-微管蛋白。

实验选择在选择性培养基中生长的稳定转化体进行菌落PCR，以测试是否发生了准确的整合，大多数整合事件都是准确的和有效的，因为在菌株的八个菌落中有七个是阳性的。

将每种菌株的阳性菌落在富培养基中培养过夜，并使用显微镜进行观察，通过使用lifeact-GFP和lifeact-mCherry标记的肌动蛋白贴片和电缆，可以在所有三种构建体中使用传统的宽场显微镜进行可视化。