24 ℃静置培养3～4 d，过滤收集幼嫩菌丝体，用无菌水、甘露醇洗涤4次；加入混合酶液中（2%溶壁酶 1%纤维素酶 1%蜗牛酶，0.22 μm滤膜过滤灭菌）。

于30 ℃、60 r/min条件下酶解2.5～3.5 h，酶解后的原生质体粗酶液通过G2烧结玻璃漏斗过滤分离原生质体和菌丝片段，原生质体滤液用0.6 mol/L甘露醇进行离心。

（4 000 r/min、10 min）、洗涤和浓缩（重复2～3次，离心前在离心管中预先加入60%蔗糖垫在离心管底部）。

得到纯净的原生质体浓缩液，采用血球计数板对酶解液和浓缩液中的原生质体进行计数。

挑取六妹羊肚菌等菌株2块，接种于置有玻璃纸（直径8.5～9.0 cm）的CYM平板上，24 ℃倒置培养72 h，长刀片刮下幼嫩菌丝，采用上述方法制备原生质体浓缩液。

1.3.2原生质体的再生

原生质体浓缩液用0.6 mol/L甘露醇适当稀释后取 100～200 μL涂布于CYM再生培养基平板进行再生培养。

或对涂布于CYM再生培养基平板上的原生质体进行紫外 线（ultraviolet，UV）诱变后再进行再生培养（紫外诱变条件： 18 W紫外灯、距离32 cm、照射30 s，红光灯下操作）。