Btw：Salzberg，这位来自约翰霍普金斯大学的科学家是开放科学（open science）的忠实拥趸，近期就有大量manuscript投放到bioRxiv上，这一点在生信人早前的文章里也有报道（水熊虫基因组乌龙事件的意义）。

作者采用的分析方法如下图所示，其中用到的好几个软件都打着“Made in Salzberg Lab”的标签。

作者首先对收集得到的近10000个RNA-seq样本进行转录组组装，得到了30,467,424个转录本（transcript）。作者用一些列条件定义了protein coding gene，包括TPM阈值，ORF长度、在其他生物种有无BLAST hit等。通过和目前人类基因组注释的比较，作者发现了1,178个新的蛋白基因。加上和Refseq有overlap的转录本，作者们最终得到21,232个编码蛋白质的基因。作者们接下来对refseq里面注释的15,779个长非编码RNA（lncRNA）进行了“质量检验”。作者进行了ORF预测，截取含有较长ORF的lncRNA基因，对它们在其他物种中进行BLAST搜索，如果达到一定标准（E-value of 10-15，75% length）则认为是潜在的protein coding gene。又经过其他一些检测之后，作者最终得到了21306个编码蛋白质的基因。

对没有比对到编码蛋白基因的转录本，作者把它们归为非编码RNA。作者找到了3,819个lncRNA 基因位点（gene locus）。其中，超过三分之一是反义（antisense）转录本，很多来自内含子。把这些lncRNA和之前发现的lncRNA加起来，作者最终得到18,484个lncRNA。再加上其他各种非编码RNA，最终非编码RNA的总数是21856。

作者还分析了可变剪切的情况。每个蛋白基因平均含12.5个isoform，而lncRNA只有2.6个。

借助来自不同组织器官的丰富的RNA-seq样本，作者用DESeq2对基因的表达情况进行了分析。Breast成为protein-coding gene男女差异最大的器官。

而testis则拥有最多上调表达的编码蛋白的基因。

最后，需要说明的是，基因的定义是有争议的话题。人们起初认为能表达的就是基因，但后来的转录组学揭示了广泛的非编码区转录现象，而其中的很多转录本可能只是转录噪声（transcription noise）。这篇preprint里，作者们以转录证据为起点并试图去除这些噪声转录本，再结合进化证据，也就是说基因要在不同物种中有一定保守性，且在不通个体中都可以看到转录（作者称为reproductivity）。基于以上三点，作者在已有的基因组注释的基础上对人类基因组进行了新的注释。虽然关于人类到底有多少（编码蛋白）基因的争论可以说暂告段落，但科学家们还在对更多与此相关的问题进行着火热的研究。一方面，RNA科学家雄心勃勃地拓展着lncRNA的版图；而另一方面，对于已知基因功能的解读还有漫漫长路。

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11.Pertea M, Shumate A, Pertea G, Varabyou A, Chang Y-C, Madugundu AK, et al. Thousands of large-scale RNA sequencing experiments yield a comprehensive new human gene list and reveal extensive transcriptional noise. bioRxiv. 2018.

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