多酶级联反应可分为线性、正交、平行、三角形和循环级联五种类型。线性级联是最简单的级联形式，涉及通过一种或多种中间体将单一底物加工成单一产品的线性生物转化序列。这种类型的级联可以缓解不利的平衡，并使不稳定或有毒中间体得到快速转化。

正交级联则由一个单一的转化反应组成，该转化反应与辅助反应相结合以促进目标产物的形成，其中一种非常常见的方法是去除不需要的副产物或通过辅因子和/或辅底物的再生来推动平衡朝所需产物的方向移动。

辅因子再生也可以通过使用平行级联来实现。与正交级联不同，平行级联包含第二个潜在有用的反应，其对辅因子转换有互补需求。

循环级联需要将一些中间体循环到起始材料中，例如在去外消旋反应中。三角级联涉及将初始底物转化为中间体，在后续步骤中再与初始底物结合。多酶级联设计可能涉及这些级联的组合版本，从而产生有趣的特性和优势。

例如，可以通过组合正交级联与线性级联来构建循环再生系统，从而允许通过对初始酶反应的中问体进行下游处理实现辅底物的再生

多酶级联反应可以在体外或体内进行。体外多酶级联反应中生物催化剂以纯酶、粗酶液或固定化酶等形式完成催化反应。体外多酶级联允许以高度灵活的方式进行一锅反应，每个反应步聚的酶量可灵活控制以实现完全转化并提供更清洁的反应。然而，各酶的破碎、纯化、浓缩和固定化需要额外的准备步骤及经济成本。此外，体外多酶级联反应往往受到酶的底/产物抑制、稳定性差、易受催化体系pH或温度波动影响的限制。若催化反应的酶需要辅因子，则体外催化由于需要添加昂贵辅因子，在成本上不具优势。

与之相比，全细胞体内多酶级联反应存在明显优势。例如，各酶在胞内完成反应避免了酶的分离纯化等诸多复杂步骤;胞内自带各种辅因子易于实现循环再生以支持多酶级联反应的顺利进行,避免或减少了对额外添加昂贵辅因子的需求，降低了经济成本:各酶在胞内共表达增加了酶的局部浓度并缩短了各酶间距离，加快了反应速率并可以避免有害中间产物的积累和扩散;细胞膜将不稳定的酶封闭在胞内相对稳定的环境中使其不易失活。

一般来说，可以使用三种形式的全细胞，每种形式各有优缺点。冻干细胞是一种方便且经济的体外生物催化剂。一旦准备好，它们就可以很容易地储存、运输和用于生物转化。然而，凉干细胞中的代谢大多是失活的，因此在反应过程中应共表达或添加用于辅因子再生的额外酶。静息细胞不生长但仍具有代谢活性因此辅因子可以通过葡萄糖等的代谢来再生。然而，它们霄要在每次生物转化之前进行培养。生长中的细胞会自我复制并在生物转化过程中继续表达酶，从而实现一锅催化剂制备和生物转化。然而，它们通常更容易受到生物转化底物/产物的抑制/毒性的影响。

对于复杂的级联反应，各酶表达水平的平衡优化是一项不可或缺但往往具有挑战性的任务。非天然多酶级联途径的构建通常涉及不同来源的蛋白质的应用，并且多个*蛋白的共表达也可能会导致显著的代谢负担,并导致所需酶的产量下降，因此，往往需要在细胞生长和蛋白质表达条件上达成妥协。此外，一些醉如P450单加氧酶由于其三维结构复杂通常难以在细菌细胞中以功能形式表达启动子工程、调整基因拷贝数和翻译效率可以帮助调节单个酶的表达水平。共表达合适的分子伴侣有助于复杂结构酶的可溶性功能表达。

对于复杂级联反应的优化，合成生物学的模块化方法至关重要。Wu等展示了一种通过长级联实现高效生物转化的模块化方法:在模块内水平，通过使用快速的最后一步反应将中间体的积累量降至最低;在模块间水平，通过使用具有不同拷贝数的质粒来调节整个模块的表达水平。这种模块化策略成功地实现了多种末端烯烃衍生产物的高转化率，对于其他复杂体内多酶级联反应的优化具有借鉴意义。