WB实验说起来简单，但是如果不注意小细节就太容易做砸，是很多童鞋心头的一抹淡淡的忧桑

因此我们制作了一些WB实验的基本操作小视频，帮助WB实验新手们全面的了解实验流程并能更快的上手操作。

首先带童鞋们了解的是转膜过程，这是WB实验成败的关键。其中“三明治”的制作尤为重要。

下面这张图片向我们展示了什么是“三明治”结构，三明治中的面包就是滤纸，而夹心就是凝胶和膜。

原理及目的：

Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

8. 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液。

9. 沸水浴中3分钟 。

10. 上样 。

11. 电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA）。

12. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟）。

13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色。

14. Westernblot 试剂盒显色。

15. 分析比较记录。

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• 槽体高强度，免除液体渗漏的困扰
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• 多重安全设计，解决操作安全问题

转膜后的封闭注意：

转膜后，膜上其他的空白位置需要用封闭液封闭。Western的灵敏度某种程度上受限于封闭做的好不好。脱脂奶是最常用的经济配方(实验太晚了还可以补充一下营养，哈哈)，用这种封闭剂由于里面可能有痕量的生物素和碱性磷酸酶，可能造成背景污染而不适合生物素—亲和素的检测方法(如果用了生物素标记的Marker而且结果背景较高，分析结果也有可能是受此影响)，脱脂奶也不适合碱性磷酸酶检测(AP)方法。如果采用碱性磷酸酶检测系统，封闭剂最好用6%酪蛋白 1%聚乙烯吡咯烷酮 10mmol/L EDTA磷酸缓冲盐加热65度1小时确保碱性磷酸酶失活(可以加0.05%叠氮化钠，新鲜最好)。经济的脱脂奶配方和AP兼容得不太好，再加上HRP的底物选择范围也更宽，现在HRP是越来越普遍的选择。但是叠氮钠(NaN3)对辣根过氮化物酶(HRP)有灭活作用，如果用HRP检测系统则封闭液不要加叠氮化钠为好。切记。封闭时间和封闭剂的量都要足够。封闭不完全，后面就全白忙活了。

如果选用AP作为显色方法，封闭时就要选择Tris缓冲体系，不要用PBS，因为PBS干扰AP。