1402年，朱棣发动靖难之役夺建文帝帝位，攻占南京后称帝，改元永乐。1421年，朱棣正式迁都北京，将南京改为留都，设南京六部等机构，行使双京制，应天府（南京）和顺天府（北京）合称二京府。1430年，郑和从南京龙江关（今下关）启航，率领2.7万余官兵，驾驶宝船61艘，开始第七次远航。

明代中叶，南京城人口达120万，成为当时世界上最大的首都。万历年间，西方传教士利玛窦游历中国后，在《利玛窦评传》中写到：“目睹南京这座大城，未免眼花缭乱……明代的南京城极其雄伟壮观，堪与十九世纪的欧洲任何最大的首都相比拟。本朝开国皇帝洪武把它造成奇迹，东方所能见到的一切都无法望其项背。”终明一朝，南京一直是南方乃至全国的政治、经济、文化中心。

1644年，明思宗朱由检殉国后，同年五月朱由崧被四镇拥立于南京，改元“弘光”，建立南明政权。1645年，清军兵临江南，攻陷南京后遂即废除国都地位，改应天府为江宁府，成为江南省省府。南京成为统辖今江苏（含上海）、安徽和江西三省军民政务的两江总督都署驻地。在经济方面南京也具有相当的重要性，在南京设立的规模庞大的江宁织造府，生产丝织品以供应皇家需求。

1842年鸦片战争战败后，同年8月清政府在南京下关江面的英国军舰“康华丽”号上签订中国近代史上第一个不平等条约《南京条约》，中国近代史由此开始。1853年太平军攻克南京，建立太平天国，改称天京，建都11年。这是中国历史上第一次在南方兴起而波及全中国的农民战争，也是世界历史上规模空前的一次农民战争。