6.1.3 GC-MS
GC-MS也常用来定量检测和确证三聚氰胺及其类似物。由于三聚氰胺及其类似物均是沸点较高的极性化合物，且均含有—OH、—NH2等极性官能团结构，难汽化，直接采用LC进行分离较为困难，不但灵敏度低且峰拖尾严重。为改善各组分LC性质，在进行仪器检测前必须对样品进行衍生化处理。
1987年，Toth等首先报道用GC-MS法来检测环丙氨嗪及其代谢物三聚氰胺。Zhu等也采用GC-MS法同时定量和确证动物源性食品中环丙氨嗪和三聚氰胺残留。样品制备时首先用酸性的乙腈或水溶液提取，然后将鸡肉或鱼肉用二氯甲烷脱脂，鸡蛋或牛奶样本用3%三氯乙酸萃取，而后提取物经MCX柱纯化，进样前用N，O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺衍生。肌肉组织中检测限为10μg/kg，牛奶和鸡蛋中检测限为5μg/kg。
王征采用N，O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺衍生化，极性的减弱使其容易汽化，有利于待测物和基质的分离，降低了背景化学噪声的影响。王立媛等用GC-MS法检测奶粉和鲜奶中三聚氰胺，加标回收率为82.3%~110.0%，相对标准偏差小于10%，方法净化效果好、准确度高、灵敏度好、重现性高。吕燕等建立了鸡蛋中三聚氰胺残留检测的GC-MS方法。采用三氯乙酸、乙酸铅混合溶液提取鸡蛋中三聚氰胺，经混合型阳离子交换固相萃取柱（Cleanert PCX，60mg/3mL）净化后衍生，生成稳定的衍生物后用GC-MS仪检测。方法灵敏度高，最低检测限为5μg/kg，回收率为72.31%~99.87%，相对标准偏差不大于11%。
但是GC-MS法需要进行衍生化，样品处理步骤复杂、过程不易控制，不适用于多杂质生物检材中三聚氰胺的快速筛查和定量分析，不能满足快速大批量检测的需要。针对此问题，李东刚等利用离子阱GC-MS仪，建立了非衍生化-GC-MS/MS直接分析饲料中三聚氰胺的方法。利用三聚氰胺的二级质谱进行定性，以二级质谱的特征离子峰m/z 85进行定量，方法的精密度为5.9%，回收率为87%~98%，可满足饲料中三聚氰胺检测的限量要求。
朱聪英等建立了用GC-MS同时检测三聚氰胺、三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺的方法。为改善各组分GC性质，样品经BSTFA衍生化后，所含氨基、羟基上的氢均可被三甲基硅烷（TMS）所取代，形成含有3个硅烷基结构的衍生物（Tri-TMS），此时的色谱行为良好。衍生化后的4种化合物的质谱图见图7-15。三聚氰胺、三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺衍生物的特征离子分别是（m/z 342、327、171、285）、（m/z 345、330、100、147）、（m/z 344、329、171、100）和（m/z 343、328、171、285），其定量离子分别是m/z 327、345、344、343。
6.2 CE
CE又称为高效毛细管电泳（HPCE），是一种以毛细管为分离通道、高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分间电荷大小和亲水性的差异而实现分离的技术。CE具有样品用量少、分析成本低、分离效率高和基质干扰程度低等优点，被广泛用于各个领域，用HPCE分析三聚氰胺的研究已有不少报道。
与HPLC法相比，HPCE法兼有电泳和色谱双重技术的特点。HPCE分离效率比HPLC法高，且分离迅速，经相同前处理后，HPCE法比HPLC法对三聚氰胺的分离效果更好；HPCE法样品消耗量比HPLC少；HPCE比HPLC经济环保，HPLC使用的色谱柱价格是毛细管柱价格的几倍。此外，HPLC分析一个样品时，时间越长消耗流动相越多，不仅价格昂贵，而且给环境造成严重的危害。而用HPCE检测一个样品只需1mL缓冲溶液，价廉易得，对环境几乎无污染。但是由于HPCE进样量少、毛细管柱内径小、光程短（CE检测窗口仅为液相检测池的1/20），它的灵敏度受到严重限制，且稳定性也有待提高，所以常规CE检测痕量三聚氰胺还有一定的局限性，只能用于含量较高的样品分析。饶钦雄等利用CE检测鸡蛋中三聚氰胺分离时间约6min，测得的定量限为0.25mg/kg。
为了提高检测灵敏度，常将CE与UVD、DAD等联合进行食品中三聚氰胺残留的痕量检测。Cernova等采用CE-UCD对奶粉中的三聚氰胺进行快速检测，其检测限可达到0.06μg/mL。Yan等提出用CE-DAD检测奶制品、鱼饲料和鱼肉等多种样品中的三聚氰胺残留。Chen等运用CE也建立了一种可同时检测牛奶中三聚氰胺和5-羟甲基呋喃甲醛的灵敏、简单和可靠的分析方法。该方法将CE和DAD联用，在检测系统中添加十二烷基磺酸钠作为筛选介质以增加分离效率。结果表明，根据迁移时间和紫外吸收光谱的不同可实现三聚氰胺和5-羟甲基呋喃甲醛的同时检测，其检测限分别为0.047μg/mL和0.067μg/mL，与HPLC法相比具有分辨率高、分析时间短、所需样品量少、分离效率好等优点。Xia等将毛细管区带电泳（CEZ）法联合二极管陈列检测器（CZE-DAD）建立了一种简单、快速、准确并可同时检测鸡蛋、宠物饲料和奶制品中的三聚氰胺及其类似物的方法。
有报道，与HPLC、荧光光度法和常规的CZE等方法相比，场放大进样-曲带毛细管电泳（FESI-CZE）具有以下明显优势：①灵敏度高。利用在线富集技术可使灵敏度提高近3个数量级，弥补了CE-UVD在测量灵敏度上的缺陷。②抗干扰能力强。在电渗流被抑制的情况下采用电进样方法，对进入毛细管中的成分具有选择性，进样时样品通过电泳作用力引入毛细管中，在正向进样电压下，仅阳离子化合物能进入毛细管中，而基质中一些中性分子或阴离子化合物不能进入或只能少量进入毛细管中，从而克服了样品中存在的部分干扰。③运行成本低，经济环保。利用FESI-CZE技术的优势，李娟等建立了基于水塞联用FESI的CZE检测多种样品中三聚氰胺的分析方法。试验条件：水塞组成为40%乙腈和60%水，水塞进入时间200s，进水压力3kPa。以120mmol/L NaH2PO4缓冲液（pH2.2）-10%甲醇为运行缓冲溶液，以0.10mmol/L NaH2PO4缓冲液（pH2.2）-20%乙腈为样品基体溶液，进样电压20kV，进样时间80s，分离电压20kV。通过在水塞后电动大体积进样可提高UVD的灵敏度，且采用电动进样，对进入毛细管中的样品具有选择性，样品基质中的一些杂质不能进入柱内，能较好地克服样品基质的影响。在优化试验条件下，与普通的CZE法比较，三聚氰胺的紫外检测灵敏度提高了800倍（图7-16），检出限由2.0mg/L降至2.5μg/L，线性范围为10~1 000μg/L，添加样品回收率为98%~106%，相对标准偏差均不高于5.1%。
6.3免疫分析法
免疫分析法在食品安全检测中应用广泛，常被用作快速筛选方法。免疫学法是一种快速检测三聚氰胺的方法，其原理是利用萃取液通过均质及振荡的方式提取样品中的三聚氰胺并进行免疫测定。该法优点是操作简便、分析速度快、可大批量筛选；缺点是与分析样品类似的结构物也可与特异性抗体发生反应，从而产生干扰，在检测过程中存在假阳性问题，对阳性样品需确证方法进行确证。
三聚氰胺事件后，国内外开始研究三聚氰胺完全抗原的合成、多克隆抗体及单克隆抗体的制备等工作。由于三聚氰胺相对分子质量仅为126，是典型的小分子半抗原，用制备的三聚氰胺人工抗原来刺激机体免疫系统产生特异性抗体。首先需要选择合适的三聚氰胺结构类似物作为半抗原进行衍生化，然后采用合适的偶联方法将其与载体蛋白连接得到完全抗原，关键在于不能破坏其表面结构和保持最小的能量转移，这对制备出高灵敏度、高特异性和稳定性的三聚氰胺抗体是至关重要的。目前主要有ELISA法和胶体金免疫层析法。
考虑到三聚氰胺具有环状对称的特殊结构，有3个氨基可供偶联载体，如果采用氨基的反应直接与蛋白连接，则3个氨基都可以同载体蛋白偶合，导致三聚氰胺完全被大分子蛋白包围，这样的抗原不能刺激产生高效价抗体。采用控制三聚氰胺和琥珀酸酐等量反应摩尔比的方法，只将其中1个氨基连接上带有羧基的4碳间隔臂以合成完全抗原。
Wang等建立了一种间接竞争ELISA法，可用于检测猪和鸡的组织及体液中三聚氰胺残留，检测限为50ng/mL，同时用GC-MS法确证，两种方法显示出很好的相关性。Lei等以碳二亚胺法合成三聚氰胺完全抗原，并免疫动物得到特异性多克隆抗体，建立了特异性检测三聚氰胺的间接竞争ELISA法，检测限为5.2ng/mL，定量限为7.6ng/mL。Liu等首先对三聚氰胺进行衍生化合成完全抗原，并免疫动物得到了三聚氰胺的多克隆抗体，建立ELISA法，并对动物肌肉组织中三聚氰胺残留进行检测，检测限为1.8ng/g，样品添加回收率为84.6%~94.3%。
Yin等制备了抗三聚氰胺单克隆抗体，并建立了检测牛奶、奶粉和动物饲料等样品中三聚氰胺残留的间接竞争ELISA法，实际样品检测限牛奶中为0.1mg/L、奶粉中为0.2mg/kg、饲料中为0.5mg/L，添加回收率为79%~110%。何方洋等利用三聚氰胺类似物与载体蛋白偶联合成免疫原及包被原，免疫BALB/c小鼠，制备了抗三聚氰胺的单克隆抗体。蔡家利等也成功制备了抗三聚氰胺单克隆抗体，检测限为0.15μg/mL，定量限为4.15μg/mL，除与三聚氰酸交叉反应率为72%外，与三嗪类药物及其他抗菌药物等交叉反应率均小于5%。
目前，采用胶体金免疫层析法对三聚氰胺进行检测的研究很少。Li等建立了食品中三聚氰胺残留检测的胶体金免疫层析法，原料乳检测限为0.05μg/mL，动物饲料和奶粉检测限为1μg/g，其他奶制品检测限为2μg/g，整个检测过程在3~10min完成。
6.4分子印迹技术
分子印迹技术是近年发展起来的一种新方法，可为人们提供具有期望结构和性质的分子聚合体。目前，新型的光响应分子印迹材料成为科研学者关注的热点。这类功能化分子印迹材料通常是将偶氮苯作为功能单体引入分子印迹材料而制得的。由于偶氮苯化合物在光照下能在顺反两种构型之间可逆地进行转变，即在紫外光的照射下，偶氮苯由反式变为顺式；在热作用或可见光条件下，偶氮苯由顺式回到反式，因此在光响应性分子印迹材料中，作为特异性结合位点而存在的偶氮苯基团在光照下能够发生异构，引起MIP材料中特异性结合空腔的巨大变化，从而导致主-客体结合能力的改变。
聂颖恬将分子印迹与偶氮苯光响应单体相结合，制备了含有偶氮苯光响应性功能单体的分子印迹水溶胶，该材料能在光照下实现对三聚氰胺分子的可控吸收和释放。此外，三聚氰胺在特异性结合空腔中与偶氮苯功能单体发生相互作用，能影响偶氮苯功能单体异构化速率，偶氮苯单体异构化速率改变的大小和三聚氰胺的浓度有关，基于此构建了一种新型的三聚氰胺快速检测法，能准确检出奶样中三聚氰胺的含量，前处理方便，测试过程快速，准确性较好，检测限可达0.25mg/kg。
Pietrzyk等以三聚氰胺为模板分子、bis（2，2’-bithienyl）-benzo-[18-crown-6]methane为功能单体、3，3′-bis[2，20-bis（2，20-bithiophene-5-yl）]thianaphthene为交联单体，通过电聚合方式制备出三聚氰胺MIP膜，建立了基于MIP膜的三聚氰胺化学传感器分析法，其检测限为5×10－9mol/L，检测线性范围为5×10－9~1×10－3mol/L。
Liang等也建立了基于MIP的电位传感器方法用于牛奶中三聚氰胺残留检测。以甲基丙烯酸为功能单体、二甲基丙烯酸乙二醇酯为交联单体制备MIP，然后联合离子选择电极检测牛奶中三聚氰胺，其检测限为6.0μmol/L。
6.5近红外吸收检测法
在三聚氰胺的分子结构中，3个C原子分别与2个N原子和1个-NH2连接。虽然C-N键的谱峰很难识别，但是-NH2的波动却是正好处于近红外区域，因此可以对三聚氰胺进行近红外分析。该方法的原理是用一种特定波长的近红外线照射被检样品，根据样品中三聚氰胺对红外线的吸收强弱来实现其含量的实时监测，该法是一种无接触、无损伤和无危害的检测方法。对于三聚氰胺而言，其含量越高所反射出的光线强度就越弱。同时该法预先扣除了蛋白质中-NH2含量的影响，选择性相对较好。
徐云等结合光谱预处理和波长选择及模型优化方法建立了测定牛奶中三聚氰胺含量的近红外定量分析模型，具有较好的稳定性和重复性（相对标准偏差小于10%）。但该法设备价格昂贵，需要不断进行校准，不同样品基质中的干扰是近红外分析精度及重现性的一大障碍。
6.6荧光分析法
三聚氰胺是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，其分子中含有共轭双键（π键）结构及3个取代基-NH2，其激发态由环外氨基上的n电子激发转移到环上而产生。由于它们n电子的电子云几乎与芳环上π轨道平行，因而实际上它们共享了共轭π电子结构，扩大了其共轭双键体系，故具有荧光特性，在非极性的介质中，它的荧光较弱，随着介质极性的提高，其荧光强度也随之增大，当它处于酸性介质中时，取代基-NH2会质子化为-NH＋，荧光强度明显减弱，甚至无荧光发生；而在弱碱性介质中，其荧光强度明显增强。
黄晖等利用三聚氰胺的荧光特性建立了用荧光分光光度法测定牛奶中三聚氰胺的方法。利用弱碱性介质中阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵（CTMAB）对三聚氰胺荧光强度的增敏作用，在pH8.00的Tris-盐酸缓冲溶液中，以CTMAB为增敏剂，用荧光光度计测定三聚氰胺，线性范围为25~1000μg/L，检出限为19μg/L，相对标准偏差为1.6%。
