3.Primer Pair Specificity Checking Parameters验证引物的特异性，选择设计引物或验证引物时的目标数据库和物种。这里提供了6种数据库：RefSeq mRNA, Refseq representative genomes，nr，RefseqRNA(refseq_rna)，Genomes for selected organism, Custom。推荐使用“Refseq representative genomes”数据库，Custom可以使用自己的序列作为搜索数据库。

用NCBI的参考序列作为模板和参考序列数据库作为标准来设计引物时，Primer-BLAST可设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的特异引物。跟其它的BLAST一样，点击底部的“Advanced parameters”有更多参数设置，但一般不用再增加参数设置了。

4．单击Get primers，有时可能需要耐心等待一会，

出现结果界面，下图是引物的可视化结果，该结果会显示出所有引物的起始和终止位置，基因的CDS区，外显子的位置等。