表示光系统 II 的反应中心与捕光天线的接触部分。LHCII 通过单体 (M，monomer) 到二聚体 (D，dimer) 及三聚体 (T，trimer) 之间的聚集平衡，“开合自如”地调控了两个传能环，启动了蛋白质分子机器。讨论中提出运用脉冲升温 (T-jump)、核磁共振 (NMR)、单分子光谱及分子生物学等手段来研究这一动态转换过程。

上述想法简单易懂，而且貌似不需要涉及过多的蛋白质动态结构细节，就很自然地把它作为创新点“具有生物活性功能的 LHCII 在类囊体膜中是以三聚体的方式存在的，我们拟将 LHCII 三聚体的动态聚合/解聚合作为研究 LHCII 通过蛋白质动态结构变化实现高效捕光功能和有效光保护功能之间切换的突破点”去申请国家项目，但是一直没有申请成功。虽然这个激动人心的猜想到2017年才彻底破灭，但却激励了10余年间不懈的探索和研究条件的积累。

图3 2005年翁羽翔、张建平讨论后黑板板书照片(讨论纪要为张建平整理)

1999年回到中国科学院物理研究所工作，当时尚未申请到百人计划的支持。组里最好的设备是先前三个组合买的一台进口YAG脉冲激光器，大家轮流使用。角落里还有一台用紫色天鹅绒布覆盖着的、由石英杜瓦瓶液氮浸式冷却放电管构成的中红外一氧化碳 (CO) 分子气体激光器。这是傅克坚研究员 (傅作义先生女儿) 的课题组留下的[4]，闲置在那里应该有5—6年之久，了解这台激光器的人都已经离开了这个实验室。当时在思考如何利用现有的条件开展有意义的研究，而不至于虚度光阴。碰巧在海淀图书城买到一本由国内多位著名科学家撰写的《21世纪的100个科学难题》[5]，其中有一篇是中国科学院生物物理研究所王志珍院士 (后来有幸与其合作) 写的文章“中心法则的空白——从新生肽到蛋白质”，谈到“蛋白质折叠问题”是科学难题，联想到我在 Emory 大学做博后时认识的乔治亚理工学院 (Georgia Institute of Technology) Mostafa El-sayed 教授的博士生王建平，他当时正在开展利用脉冲升温—纳秒时间分辨中红外光谱研究蛋白质折叠动力学，于是就下决心开展这个方向的研究。

第一件事是如何让CO激光器运转起来，在找不到知情者咨询的情况下，想到去所科技档案室碰碰运气，看看有没有相关的资料存档。没想到，李春芳老师居然从档案室给了我一个厚厚的资料袋，里面不但有研制任务书，还有图纸及仪器验收指标，关键还有这台设备的研制单位大连理工大学的联系人和电话。凭借这个电话号码，找到了大连理工大学的于清旭教授，从此开展了后来持续多年的CO激光器升级换代工作。2001年开始连续三年向自然科学基金委员会递交应用脉冲升温—时间分辨中红外激光光谱研究蛋白质动态结构的申请，直到第三次申请才终于获得了面上基金的资助。多年后才知道，项目进入会评阶段多亏了当时只有一面之缘的大连化学物理研究所李灿院士的支持。期间在于老师的指导下，学会了CO激光器的出光调试，但是这台老激光器一旦连续运行起来，问题便层出不穷，不是变压器被烧坏，就是大电容被击穿，而且激光稳定性差，就连真空橡胶抽气管用几回也会穿孔破裂，如此等等，不一而足。记得那年冬天，几乎十个指头都缠着胶布。有一次无意中看到一篇资料讲到臭氧对人体皮肤的损害，联想CO激光器放电后石英管中会残存大量蓝色的液态臭氧，不仅腐蚀人的皮肤，肯定也会腐蚀真空橡胶管，由此一举解决了手指皲裂和真空橡胶管被腐蚀的问题。那段时间正好我父亲来北京，很少有时间陪他出去转。老人家从乡下来，满怀希望地想见识一下在中国科学院物理研究所就职、多年游学海外的“海归学子”。看到我每天早出晚归，忙忙碌碌的样子，父亲很是失望，在我家住了一个月就回去了。临走时扔下一句话：“都以为你是个海归，我看你就是一个打工仔”。是的，对不起了父亲，我本来就是一个打工仔，不同的是，这回是为自己打工，为自己的国家打工。

还有一个问题是光路的实时调节。红外激光看不见，因此设计激光器时在镀金的端面反射镜上开了一个 5 mm 的小孔，引入氦氖激光作为指示光。激光放电管由中间的正极 (零电位) 和石英管两端各一个负极构成。正负电极之间的电压为7千多伏。接线柱在激光器靠墙的一侧，但裸露在空气中，平时不会碰到接线柱。在调节谐振腔光路时，需要两人配合，一人的手臂要从靠墙的一面空隙中伸到输出镜侧的定位光阑处，通过开闭光阑查看指示光的位置，指挥另一人调节端面镜的反射光路。实际操作中，我担当“指挥员”的角色。为了安全起见，先在地上铺上绝缘的胶垫，再穿上胶底拖鞋，心想即使碰到负极，身体也只不过是个等电势体，应该不会发生什么意外。在一次调光路过程中，我和张庆利同学(该方向第一个研究生)都穿着短袖。我左手臂无意中碰到电极，而恰在这个时候，张庆利的手臂碰到了我的右胳膊，顿时感觉到一股电流涌向心脏，引起心脏疯狂地跳动，令人窒息。而这时左手腕带的金属表和皮肤之间也放起电来，除了蓝色的电光外，还发出一股焦糊味。奇怪的是，张庆利居然一点感觉也没有，原来是 7600 V 电压通过他 (零电位) 把我给接地了！2006年在厦门大学召开的全国跨学科蛋白质大会上，我在报告中亮出了这句感悟：做科研是“有钱的玩钱，没钱的玩命”，没想到这成了那届会议被引用最多的一句话。

脉冲升温—纳秒时间分辨红外光谱研究蛋白质动态结构的原理是，红外光谱能够识别蛋白质的二级结构，如α-螺旋、β-折叠、无规卷曲、环折结构及分子间氢键等。而激光脉冲升温方法可以给蛋白质一个快速的扰动，一般由脉宽为10 ns的脉冲激光激发水或氘代水的泛频吸收，可在20 ns时间内引起体系约20 ℃的温升，比传统的反应停留法测定蛋白质折叠动力学的时间分辨率高出几个数量级。然而常规的掺钕YAG激光器1.064 μm的基频输出无法直接用作加热脉冲，必须经过一个以高压氢气为介质的拉曼频移器，将基频红移到2 μm左右。拉曼频移器看起来很简单，在一段不锈钢管的两端分别安装上石英窗口。但要保证其在几十个大气压下安全工作，谁也没有把握。2002年访问日本东京大学的一个光谱实验室，听说一个充有80个大气压的拉曼频移器出了事故，石英窗片被高压气体推出，在对面的墙上砸出了一个大洞，幸亏没有伤着人。尽管有风险，还是想由自己设计加工，并就此事请教许祖彦院士。许先生告诉我们，清华大学的娄彩云教授做过拉曼频移器用以产生通讯波段的激光 (1.54 μm，用甲烷做介质)。就这样从娄老师那里拿到了拉曼频移器，额定安全工作气压为20个大气压。实验中激光转换效率太低，王莉同学 (北京理工大学联合培养的研究生) 把气体池加长，又在娄老师的指导下提心吊胆地把气压一点点提高到30个大气压，总算满足了实验要求。这时张庆利同学也把CO稳定性提高到了较为满意的水平，与加热脉冲激光联用后，实现了探测光吸收变化率 (ΔOD) 测量精度为10^（-3）的基本要求[6]。当时经费缺乏，连王莉的工资都开不出来了，于是硬着头皮去找杨国桢院士帮我想想办法，以解燃眉之急。没想到杨先生听完我说的困难后，爽快地把他当年的院士个人支配的创新经费（3万元）转给了我。

2006年叶满萍同学开始了LHCII三聚体的变温红外和脉冲—升温时间分辨红外光谱研究，样品通过匡先生介绍由中国科学院植物研究所王可宾老师提供。当时面临的最大问题是单波长扫描测量的瞬态红外光谱重复性不好，于是将红外光分成两路，一路探测样品，一路作为参考光，实时扣除CO激光强度抖动，尽管数据质量明显提高，但重现性还是差强人意。最后只好从几十套瞬态光谱数据中挑出几套自认为可靠性高的进行平均，但仍然难以确定光谱测量的准确性。2008年5月，叶满萍毕业并联系好去东京大学做博士后，按计划9月份去日本。看着这一堆尚未有头绪的数据，就和她商量，能否再利用去日本前这段空档时间，多重复几套数据，给出一个可信的结果？得到的答复是：“从6月6号开始，我已经不是物理所的人了！”，言外之意是老师的指挥棒失灵了。尽管回答让我感到有些突然，冷静下来还是深刻反思一下为什么会这样？连实验技能已经很熟练的学生也在刻意回避和逃离这个课题，换个新手会有改善吗？答案是否定的，仔细研究实验数据后，得出的结论是，测量精度必须提高一个数量级，即达到10^（-4）ΔOD 才能够获得可信的数据！没有别的捷径，只能改造升级实验设备！而且必须抛弃使用拉曼频移器这一通用做法。因为实验发现由于高能量激光对气体池的加热效应，导致拉曼频移输出光在空间位置的重现性差，进而导致加热激光和探测光焦点在样品中的空间重合无法保障。另外CO激光输出功率的稳定性也有待于进一步提高。新的方案是将加热脉冲改用掺钬的YAG激光，直接获得2 μm的基频输出。但是这种激光器没有商用产品，要自己研发。

2008年10月获得了中科院重点仪器研发项目的资助，其中研制掺钬YAG激光器的工作由中国科学院安徽光学精密机械研究所的合作者承担，新一代脉冲升温—纳秒时间分辨中红外瞬态吸收光谱仪的调试工作由李得勇同学负责。记得第一次在新的设备上看到瞬态信号时，原来的热切希望被活生生地浇灭了：仪器的电磁干扰信号居然高达1.5 V，主要来自于钬激光电源。我把多年积累的经验用上后，总算把噪声降到了10 mV的水平，然后和李得勇讲，10 mV的噪声水平是我做博士年代的水平，20多年过去了，技术方法总归有很大的长进吧，下面就看你的了，我的要求是毫伏量级。经过各种试错(trial-and-error)，终于实现了这个目标[7]。

2015年中国科学院物理研究所科研简报“高精度脉冲升温—纳秒时间分辨中红外瞬态光谱仪的成功研制”写到：2015年5月27日，Review of Scientific Instruments发表了中国科学院物理研究所软物质院重点实验室翁羽翔研究组的一篇题为 “A Q-switched Ho: YAG laser assisted nanosecond time resolved T-jump transient mid-IR absorbance spectroscopy with high sensitivity”的仪器研制论文[8]，报道了新一代具有国际先进水平的脉冲升温—纳秒时间分辨中红外吸收差光谱仪的成功研制；包括研制高稳定连续输出可调谐一氧化碳中红外激光探测光源，以及研制新型的脉冲激光加热光源，即空间模式稳定、输出能量稳定的纳秒调Q 的Ho: YAG 脉冲近红外激光光源 (2.1 μm，与中国科学院安徽光学精密机械研究所吴先友研究员合作) 。该设备对蛋白质细胞色素c的脉冲升温—时间分辨中红外光谱测量结果表明，在蛋白质酰胺 I'光谱范围 (1600-1700 cm^（-1）) 内达到的平均测量精度为2×10^（-4） ΔOD。简报的开头是这样写的：“十年磨一剑，不敢试锋芒，再磨十年剑，泰山石敢挡”。现在看来LHCII就是一块用来试剑的泰山石。

图4 作者(左)和李姗姗(右)向王志珍院士(中)讨教蛋白质折叠动力学问题(2010年12月摄于生物物理所王先生办公室)

和李得勇同学同年入所的李姗姗同学则投入了LHCII的研究工作中。由于研究工作一直没有获得实质性的结果，也不好意思再向植物所要样品了，最好的解决方案是自己能够提取样品，并由此掌握提取蛋白样品过程中所添加的试剂成份和含量。幸运的是，中国石油大学黄岛校区黄方教授组里的刘双老师愿意教我们，李姗姗就在那里学会了从菠菜叶片中提取LHCII的实验方法。由于仪器研制过程中碰到许多预想不到的困难，李姗姗没有等到新的设备，而LHCII稳态光谱的数据尚不能够说明问题，她离毕业要求还差一篇论文，就提出把LHCII的初步结果整理后投给国内的期刊，我没有答应。在延期毕业的日子里，李姗姗只好应用旧的脉冲升温—时间分辨中红外光谱仪研究北京大学生命科学学院昌增益教授提供的热休克蛋白，在修改稿返回给Scientific Report 编辑部漫长的三周时间等待中，延期毕业、就业竞争以及生活与家庭，似乎所有的成功与否都维系在一篇论文是否被接收上，来自数方面的压力差一点将她压垮了。差不多是第三周的一个晚上，晚饭后照例查一查邮件，当看到了编辑部的接收函时，便一下子从椅子上跳了起来，大声嚷嚷“接收啦！接收啦！”，以致我太太跑过来看到我当时的情形，冷冷地说了一句“你们这些搞科研的，一个个像范进中举似的，不就一篇文章，至于吗？”，我当时的回答是：“你知道吗？一篇文章一条命！”

美国明尼苏达大学化学系和超算中心的高加力教授是分子动力学模拟研究的专家，是分子动力学模拟的鼻祖、诺贝尔化学奖得主哈佛大学Martin Karplus教授的高足。我和他在2015年基金委物理化学处重点项目答辩会上初次见面，高老师来做申请答辩，他与吉林大学理论化学研究所开展合作研究工作，我是当时的评审专家。那年评审会印象深刻，年轻学者如复旦大学的刘志攀教授等胜出，而两员老将高老师还有中国科学技术大学的严以京教授则铩羽而归。第二年高老师继续参加答辩，项目是应用分子动力学模拟的方法计算蛋白质二级结构的红外光谱，精度达到 1 cm^（-1）。这样的申请报告对我而言不啻是高山流水之音。一激动，就做了一番即席发言。高老师那年终于拿到了项目，也许就是因为这一番发言，他便知道了国内有位运用红外光谱解析蛋白质二级结构的翁羽翔。那年9月份，高老师和他的同事李辉教授突然造访中国科学院物理研究所，就在物理所“总理咖啡屋”一叙。寒暄过后，就切入正题，我非常希望能够和这样的高人开展合作，于是就在咖啡屋的电子屏幕上给高老师介绍起了高等植物捕光天线的非光化学淬灭和我们的LHCII三聚体动态聚合/解聚调控的想法和研究进展。

在长期的进化中，植物发展出多种不同时间尺度与空间尺度的光保护机制，其中一种极为重要的机制叫做非光化学淬灭。非光化学淬灭发生的场所主要在类囊体膜，其淬灭位点包括光系统II主要捕光天线三聚体(LHCII trimer)与内周辅助捕光天线单体 (CP29、CP26、CP24)。捕光天线将过量的激发能在微秒时间尺度内以热的形式耗散到环境中。尤其是捕光天线 LHCII，叶绿体中的含量最高约占60%左右。晶体结构表明，LHCII单体包含6个叶绿素b，8个叶绿素a，与4个类胡萝卜素分子：两个叶黄素 (lutein)，一个新叶黄素分子 (9'-cis Neaxanthin) 以及花药黄素 (antheraxanthin，叶黄素循环的中间体) 。其中，LHCII 的蛋白质骨架由三段跨膜α-螺旋(A， B，C)构成，A和B呈剪叉式排列，交叉点由两对带正负电荷的氨基酸 (Arg70-Glu180，Glu65-Arg185) 通过形成盐桥锁定；类囊体腔侧包含

​β股结构相连。叶绿素分子“镶嵌”在蛋白质骨架上，彼此之间以特定的取向和距离有序分布，在捕获光子与传递光能的过程中发挥着重要的作用。类胡萝卜素分子主要分布在叶绿素分子的周围，通过及时清除自由基氧和过多的光能，保护植物免受过多光能的损伤，蛋白质骨架为这些色素分子提供结合位点。
当时我们以为已经获得了LHCII三聚体解聚的初步证据，实验方案是这样的：依据晶体结构，LHCII三聚体中，单体界面处存在一些结合的水分子，在室温条件下，没有暴露出来的水分子不会和溶剂氘代水进行氢氘交换，如果发生热解聚，随着温度的升高，结合的水分子会释放出来进行氢氘交换后形成HOD，并且在红外光谱1450 cm^（-1）处出现有别于H2O和D2O的特征峰。前期叶满萍、李姗姗和后来的李昊同学，他们的变温红外光谱的数据都证实1450 cm^（-1）的吸收强度随温度升高而增强。最后希望高老师能够和我们合作，用分子力学模拟揭示LHCII随着温度升高的解聚过程，证实LHCII三聚体动态聚合/解聚的想法，因为到目前为止，稳态和瞬态光谱数据既无法证实，也没有否定该想法。

大约半年后，高加力教授第二次来到物理所，同样在咖啡屋，只是演讲的主角换成了高老师。高老师先展示了由24万多个原子构成的LHCII三聚体、磷脂双层膜和水分子构成的起始模型，然后演示了三聚体在高温下存在的一个开合运动，以及界面结合处水分子随温度升高逐渐脱落的过程。当看到水分子的确随着温度的升高从界面处脱落，这一点和实验相符时，感到很高兴。但接下来是令人困惑的问题：分子动力学模拟根本没有揭示三聚体存在随温度升高而解聚的迹象！结合植物所卢从明研究组2007年在Plant Physiology 上发表的实验工作[9]，他们的结果表明LHCII三聚体随着温度的升高确实发生了非光化学淬灭 (NPQ，non-photochemical quenching)，但没有发生三聚体的解聚，而是热诱导三聚体聚集过程。面对上述事实，不得不放下幻想，眼前一片迷茫，就像吹灭了十多年来照亮在黑暗中摸索的一盏油灯，此刻又重新陷入了彻底的黑暗。怎么办？投入了这么多的人力、物力和时间，难道就此打住？冷静下来后意识到原来为什么这么执着于这个想法，有深层次的原因，那就是对海量生物文献的恐惧，因为只要物理模型成功，就没有必要去了解生物学上的细节。在当前这种进退维谷的情形下，唯有扎扎实实地做好文献调研，理清学术脉络才有重新启航的希望。接下来在查阅大量与荧光非光化学淬灭的相关文献后认识到 (到论文发表为止，阅读了近500篇论文) ，国际上对于NPQ的机制原来一直是有争论的，尽管如此，以英国伦敦玛丽皇后大学的Alexander Ruban教授为代表的一派提出的机理十分吸引人，也基本上处于主流地位，即一对交叉排列的叶黄素分子，各带一个叶绿素a分子，形成两对叶黄素—叶绿素色素对，当色素对中叶绿素与叶黄素分子间距较远时，叶黄素分子将光谱蓝区捕获的能量传给激发态能量较低的叶绿素分子，实现高效捕光；如果两者靠得很近，则叶绿素将激发态能量传给叶黄素的光学暗态，再由该暗态将激发能以热的形式耗散掉，并把调控过程归结于蛋白质的构象变化。然而蛋白质构象是如何实现这一“智能”调控的，仍然是一片空白。于是对LHCII变温红外光谱进行仔细的解析，找出各个红外吸收峰在变温过程中的相关性，结合晶体结构信息，尽量找出空间相邻的二级结构的对应关系，希望在